Sambrook, Russell - Molecular cloning. Laboratory manual - v.2 (522942), страница 44
Текст из файла (страница 44)
А!тегпадче!у, 5етрлепате чегыоп 2.0 Щ5В 5реста1ту ВюсЬеписа!ь) ог чапаптв оЕ тЬе К1еполч Ета8шепт йат !ас1с 3' — э5' ехопис1еаае асдиту (Втгатацепе ог Хенч Еп81апд Вю1аЬа) сап Ье иаес1. ВотЬ оЕ йеае епхушеа!ас1с йе 3' — +5' ехопис1еаае асбчау оЕ тЬе К1епоъч Ета8шепт. Кат1!о1аЬе! Вапдош рппип8 геас6опа туркаПу сопташ опе гадбо1аЬе1ед [а-ллр]д)ч(ТР (ьр. аст. 3000 С(Епппо!е) апд йгее ип1аЪе1ед дХТРь аа ргесигаогя ()пдег йе геастюп сопс66опа деаспЬед ш тЬ(а рготосо!, 40 — 8098 оЕ йе [а-ллр]дЬ)ТР !а !псогрогатед (пто Ел!)А апд йе аресгбс ас6чбу оЕ йе гагбо1аЪе1ет1 ргодисгч абел Егош ! х 1Оч то 4 х 1Оч дрпь)л8, с1ерепсбп8 оп тЬе аптоипт оЕ тетпр1ате ЕтМА ш тЬе геас6оп.
А1тЬоиВЬ ЬтВЬег арес!Етс аст(ч(т!еа сап Ъе Вепегатед иып8 тччо [а-ллр]д)4ТРа аь ргесигтюгя тЬе геял!тш8 ргоЬеь де8гаде чету гарЫ!у дие то гаебосЬешка1 с1есау (Втепт апд Риегат 1960) апс1 шиат тЬеге(оге Ье иаед чч)тЬоит т1е1ау. ЪЪеп [а-ллр]д!чТР оЕ !отчет арес(Етс асдч!ту !а иаед аа а ргесигаог (е.8., 800 Сйппю!е), йе у!е1д оЕ ЕтХА (а !псгеааед Еоиг!о1т1 апд !та прес!Етс аст!ч(ту )а гетЬлсет1 то (1Оч дрш!)лц. 5исЬ ргоЬеа аге плоте йап адет)пате Еог пюы ршроаеь апд сап Ье а!отед !хохеп Еог аечега1 дауа Ье!оге гасбо1утк де8гадатюп Ьесошеь а ргоЫеш. Е)еохупис!еотЫе тпрЬоарЬатеа тЬат саггу герогтег 8гоирь аисЬ аа д(8ох(8еп)п сап Ье аиЬ- ат)!отед Еог гасбоасттче пис1еотЫея Арргохппате1у опе аспид(Етед Ьаае (а тпсогрогатес1 рег 25 — 35 пис1еотЫеь оЕ ЕлМА аупйеяхед дигшц а атапдагд гапдош рппип8 геастюп (Кета!ег ет а!.
1990). Рот ЕигтЬег ш(оппатюп, р!еаье аее Аррепйх 9. Ргипег5 01!Вопис1еотЫе рг(шегв сап Ье Вепегатед Ьу Е)Хазе 1 д(Веют(оп оЕ са1Е тЬушиа Е)МА, Ьу ауптЬеяа оп ап ашоптатед ЕлЕ4А ауптЬеягег, ог, Еаг пюге еая!у, Ъу ригсЬаае Еготп а сопипегс(а1 зоигсе. ТЬе 1епВтЬ оЕ тЬе рг(шега 1а сгиста1. ОВВопис!еотЫеь ьЬогтег йап ях Ьааеа тп )еп8тЬ аге чету роот ргипегя ччЬегеаа тЬоье 1опцег йап аечеп Ьаьеа !п 1еп8тЬ Ьаче рго8геаяче1у Вгеатег тепдепсу то ае1Е-аппеа! апд ае1Е-ргппе (5и8апшпа апд Сирла 1995). 1деа1!у, йегеЕоге, рори1атюпь оЕ о118опис!еотЫеь иаед !п гапт1отп рппип8 ьЬои1д Ье еВЬег ях ог ьечеп пис1еот!деа !п !еп8тЬ. А11 роьяЫе ьет)пепси вЬои1д Ье гергеьептед тп тЬе рори1адоп ат ет)иа1 Егес)иепс!ея ТЬе ачега8е яге оЕ йе ргоЬе Вепегатед дипп8 гапдош рппип8 геастюпа (а ап !пчегае Еипсдоп оЕ тЬе сопсептгадоп оЕ ргппег (НодВаоп апд Р(а)с 1987): ТЬе !еп8й оЕ гагВо!аЬе1ед ргодист = )т!'ПпРс, лчЬеге Р, (а тЬе сопсептгатюп оЕ рпгпег.
ТЬе атапдагд рптпш8 геасдоп деьспЬед тп тЬ)а рготосо1 сопташа Ьетлчееп 60 п8 апд !25 п8 оЕ гапдош Ьехагпега ог Ьерсашега апд Вепегатеа гагВо1аЬе1ед ргодиста тЬат аге -400 — 600 9.6 СЬаргег 9: Ргерагапоп о!" Ртаг((о!аЬе!ет! РИА алт! ЯХА РтЬеь пис1еоСЫеь тп 1еп8й, аь г(етегпнпес( Ъу е1есСгорЬогеяь СЬгои8Ь еЬЬег ап а1)га1!пе а8агоье 8е1 ог а депасипп8 ро1уасгу)ашЫе 8е). Н!8Ьег сопсепсгасюпь от рпгпег 1еас( со ьсепс Ь!пс(тапсе ог со ехЬаитйоп ог СЬе (и-ьтр) г)МТР ргесигьог тч(СЬ а сопсотппапС с1ергеьяоп от" у!еЫ; !Отчег сопсепсгапопь от ргппег 8епегасе рори1апопь от" гайо1аЬе1ет( ргог(иссь йас аге ьо Ьесего8епеоиь тп 1еп8сЬ (ОА-4 1сЬ; Нот)8ьоп апг) РЬ1с 1987) йас сЬеу тчои1д Ъе ехрессес( со ЬуЬпйге тч(сЬ апоша1оиь Ыпепсь. Тепср!аде ОНА ТЬе геассюп сопйсюпь 8(чеп ш СЬть ргососо1, ас)арсег( Сготп РешЬег8 апс) Чоце1ьсе!и (1983, 1984), аге орс(ппгед Сог 1аЪе1!08 от" 1!пеаг т)оиЫе-ьсгаптсет( 13ХА сегпр1асеь ир со 1 1сЬ тп (еп8й.
5Ьогтег РХА Сетпр1атеь 8епегаСе ргоЬеь от' 1ои ьрес(гтс асСпВСу СЬаС с(о поС ЬуЬпйге тче!! ипдег ьспп8епс сопйпопь. С1оьег1 стгси!аг, с(оиЫе-ьсгапт(ет( 1)Ь(Аь аге !пеСТтс(епс сешр1асеь апт( ьЬои!й Ъе сопчегсет! со 1шеаг тпо1еси)еь Ьу й8еьпоп тч(сЬ а геьспссюп епгуше Ьетоге иье тп а гапс1ош рппип8 геассюп. Чт(Ьегечег ргаспсаЫе, а рипттес( ье8шепс ог" саг8ес 1)схА ьЬои1Й Ъе пьет! аь а септр)асе, гайег сЬап ап еппге р1аяпЫ.
ТЬ(ь 8геас1у ьирргеььеь сЬе 1ече1 ог" Ьас)с8гоипгс тчЬеп йе гайо1аЬе1ег! Т)ЫА (ь пьес( аь а ЬуЬпйгасюп ргоЬе (РетпЬег8 апт( Чо8е1ьсеш 1983, 1984). МАТЕК!АЕй САОТЮЬ): Р!еаье ьее Аррепйх 72 (ог арргорпате Ьапт)1!п8 о! гпатепа1ь гпагЬетС ъч!СЬ <! >. Войегь апд 5о!цйоп5 Р1еаье ьее Аррепйх 7 (ог соптропепть о! ьтосЬ ьо!ипопь, Ьийегь, аптс геа8епгя О!сите ьтосЬ ьоситюпь Со СЬе арргорпате сопсепСгапопь. Аглтолшгл асетате (70 м) Ориопа!, рсеаье ьее 5сер 5. Есаапо! Орсюпа!, р1еаье ьее 5сер 5. )ь(А ьсор(ьсогаде Ьиггег 50 том Тга-Сс (рН 7.5) 50 гом СсаС( 5 гом ЕОТА (рН Ь.О) 0.596 (тч(ч) 5О5 5х Ргалс(от рг(т(лд ЬОЯег 250 гом Тга (рН Ь.О) 25 гом МОС( 100 гпм 5(аС( 70 гом йтЬюСЬгеао1 С М НЕРЕ5 (ат))иьтет( Со рН 6.6 члй 4 М Ь)аОН) С)ье а (геьЬ й!ипоп !и НтО оЕ С М йсЬюсЬге!со1 ьтос(т, ьтогет( ас -20 С. Расапс тЬе йсосеа ййюйгепо) а(сег иье. Епгугпеь апс! Войегь Кlелотч Ггадтелг от' Е.
со1! 07ЧА ро(утегаье ! Се!5 А7)са((ле а8агоье 8е! ог с(еласиг(л8 ро(уасгу(атЫе 8е! <1> Рсеаье ьее 5тер 4. Ргогосоl 1: Капаот Рг(т(ие: Ка|Г!о!аЬе!!ие оЕ Ригг()е|Е РИА ргариеигл 9.7 М)ис1е1с Асн15 апд О1фопис!ео1Ые5 г)7|)ТР ео(ирои сои!а!и!ид !!нее ип1аЬе1есЕ сГМТР5, еасИ аС 5 тм ТЬе согпроысюи оЕ й|а |ю!ниои йереи|Ь ои сЬе (а-||Р1 йХТР со Ье |пей. !Г гай!о!аЬе!ей йАТР ыпей, ЕЬе гп|х гЬон!й сопсаш йСТР, йТТР, аий йОТР еасЬ ас а соисепсгайои оЕ 5 шсчс. !Е ичо гай!о!аЪе!ей йХТРа аге наей, сна ао1ниоп лЬои!й соисаш сЬе о|Ьег слчо йХТРа еасЬ ас а соисепсгайои оЕ 5 шхс. Рог айч!се ои и|а!йод апй асог!па а|ос!с |ю! шюиа оЕ йХТРа, р1еаае аее йе! исоииаиоп раие1 ои РССЕРАССАТ!ОМ ОЕ 5ТОСК 5ОШТ1ОМ5 ОЕ йМТРа АМ0 ййМРТа РОСС РМА 5ЕС2ОЕМС!МС |и СЬареег 12. Каис(от сГеокупис1еог(гГе рп теса а)к ог аечеп Ьааее )и!еиКСЬ (725 пфр)!и ТЕ, рН 7.
6) Веса|ье оЕ сЬесг нп!Еопи !еиасЬ аий!ас1| оЕ лег(пенсе Ь|ая ауи|Ьейс о1!анаис!еос!йеа оЕ гапйоп| ее|!пенсе аге |Ье рпшега оЕ сЬо!се. О!!Воине!еос|йеа оЕ оригиа! 1епцй (Ьехагпегл апй Ьерсашегя 5иааииша апй борга 1995) саи Ье ригсЬааей Гго|и а сопипегс|а! аоигсе (е.а., РЬагшас|а ог ВоеЬ|!иаег МапиЬеип) ог ауисЬеа!гей 1оса1!у ои ап ашошасей РЬГА ауи|Ьеягег. 5соге |Ье |и!нсюи оЕ рг!шага ас — 20'С |и аша!1 а!!цнося Тетр)аге ЕлХА (5-25 па1(с)) Ги ТЕ ГрН 7.6) РнпЕу ГЬе РМА со Ье гай!о!аЬе!ей Ъу опе оГ |Ье гие|Ьо|Ь йеаспЬей ш СЬарсег 5.
Тсйа ргососо! |еог(га Ъеас лчЬеи 25 иа оЕ сешр!асе РХА Ь алей ш а асапйагй 50-И! геассюп. Сагаег агионпь оЕ РМА аеиегасе ргоЬеа оЕ !оиег арес!Есс асспйсу; ашаБег аиюнпса оЕ РМА ге|Сшге !опаег геасгюп йшеа. Р!еаае аее носе со 5сер 4. Кас11оасбсге Сотпроипс15 !а-лгР!гГАЕТР (70 тС|!тl, ер. асг. >3000 С|1тто(е) <! > То папиные ргоЫеша са|пей Ьу гай!о!уа!а оНЬе ргесшаог, |с Ь Ьеас, лчЬеиечег рога!Ъ|е, со ргераге гайр о!аЬе! ей ргоЬеа ои |Ье йау |Ье (лгр)йХТР агпчеа ш |Ье 1аЬогасогу. Ьрес1а! Е41и1ртпеп$ Во!1(пд игаСег ЬаСЬ ог ЬеаСГиц Ь)ос)г ргеаеС Со 95 С Гч)(сгоуиде сиЬеа (0.5 гп!) 5ерЬагГех С-50 арии соlитп, ег7и!1!ЬгаСег! т ТЕ ГрН 7.6) Ориона!, р1еаае аее 5сер 5.
МЕТНОО 1. 1п а 0.5-ш! ш(сгоуиие СнЪе, сошЪ|пе Сегпр!аСе РМА (25 пц) ш 30 Сс! оГ Н,О сч(СЬ 1 Сл! оЕ гап|1огп йеохупис1еоспйе рПшега (-125 пц). С1оае сЬе сор оЕ сЬе сиЪе с(КЬ11у апй р!асе йе сиЬе Гп а Ъо(1(пи лчасег Ъай Еог 2 ппписея 2. Кешоче йе шЬе апй р1асе Ь оп Гсе Гог 1 пппше. Сепсг!6лКе сЬе сиЬе Еог 10 аесопйа ас 4'С ш а ппсгоЕиие со сопсепсгасе сЬе ппхсше оГ ргппег апй сеспр1асе ас йе Ьоссош оЕ йе сиЬе. Кесигп сЬе шЪе со йе ссе Ъай. 3.
То сЬе ш(хсиге оЕ рпп|ег ап|1 сегпр1асе, а|Ы: 5 шМ йМТР ао!нл!ои ! Н! 5х гапйош рг!пипа ЬнСТег !О и! 10 шСУги! (а-пр)йМТР 5 Н1 (ар. асс. 3000 Санино!е) Н,О Со 50 И! 4. А|Ы 5 ишь (-1 С|1) оГ сЬе К!епосч Егаашепс. М|х йе сошропепь Ьу цепс!у саррши сЬе оися|1е оЕ сЬе сиЬе. Сепсг(уиве сЬе сиЬе ас гпахигпип ареей Еог 1 — 2 аесопйа !и а ш(сгоЕиие со сгапаЕег аП сЬе 11с(и(й со сЬе Ъоссогп оГ сЬе спЬе. 1пспЬасе сЬе геасбоп ппхшге Еог 60 ш!пи!ее ас гоош сешрегасиге. 9.8 СБарсег 9: Ргерагас(оп о)' Рсаг)(о!аЬе!егЕ РИА апй ЯМА РгоЬея То !аЬе! !агцег ашоипь оЕ РХА, ашегпЫе геассюп пихшгея ая йеяспЪей гп цсеря 5 апй 4 апй сЬеп шсиЬасе сЬе геаебоп Еог бО пиписея.
То !аЬе! яша1!ег агпоипся оЕ РХА, шсиЬасе сЬе геассюпя Еог 6гпея сЬас аге сп !пчегяе ргорогсюп со сЬе апюипс о( сепср1асе аййей. рог ехагпр!е, гапйогп ргипспц геас6опя согиашшц 10 пц оЕ сешр1асе РМА яЬои1й Ъе !псиЬасей Еог 2.5 Ьоигя. То пюшсог сЬе соигяе оЕ сЬе геаспоп, гпеаяиге сЬе ргорогс!оп оЕ гайо!аЬе1ей йМТРя сцас еЬЬег ы )псогрогасей шсо шасепа! ргессрпасей Ьу спсЫогоасе6с асЫ (ТСА) ог айЬегея со а РЕ-8 ! ц Ь сег (р1еаяе яее Аррепйх 8).
С)пйег сцеяе геассюп сопйбопя, сЬе !епцсЬ оЕ сЬе гайо!аЬе!ей ргойисс ы -400 — б00 пис1еосЫея, ая йесегпппей Ьу е!ессгорЬогея!я сцгоицЬ ап ацга!!пе ацагояе це! (СЬарсег 5, ргососо! 8) ог а йепасиппц ро1уасгу!агпЫе це! (СЬарсег 12, Ргососо! 8). 5. Айй 1О )с! оЕХА асор)ясогаце ЬОЕЕег со сЬе геассюп, апй ргосеей чч!64 опе оЕЕЬе Ео!!оиг(пц ор6опя ая арргорпасе. ° йоге сЬе гайо!аЪе!ей ргоЬе ас — 20'С ипс!! Ь Ы пеес1ей Еог ЬуЬпйгасюп. ° церагасе ЕЬе гайо!аЬе!ей ргоЬе Егопс ипйпсогрогасег1 й)ч)ТРя Ьу еЬЬег хрип-соЬппп сЬгопсасоцгарЬу (р1еаяе яее Аррепйх 8) ог яе!ес6не ргес!р!сас(оп оЕ ЕЬе гайо1аЬе1ей ())ч)А чяйсЬ апппопшпс асесасе апг1 есЬапо1 (р1еаяе яее Аррепйх 8).
ТЬся ясер ы цепега1- 1у пос гес!и!гей 1Е >50% оЕ сЬе гайо1аЬе1ес1 йМТР Ьая Ьееп спсогрогасег1 г1пгшц сЬе геассюп. Аяяиш!пц сЬас 5098 оЕ сце гайюасспбсу Ьая Ьееп шсогрогасей шсо ТСА-ргее!ргсаЫе гпасепа! йигшц сЬе гапйогп рппипц геас6оп апй сЬас 9048 оЕ 6ия псасепа! Ьая Ьееп цепегасей Ьу гапйош рппипц ечепся оп сце сешр!асе РЬСА (гасцег сЬап яе!Е-рппипц оЕ о!!цопис!еобйея), сЬеп сЬе ргоЬе РМА чгои!й гоп!а!и а соса1 оЕ -4.5 х !Ог йрпг (епоицЬ Еог сячо со цче цоийгегп ЬуЬпйысюпя о( псапипа1!ап цепопие РМА).
ТЬе ярессцс асс!ч!су оЕ сЬе ргоЬе ячои!й Ье -!.8 х ! 0' <срш)цц апй сЬе яче!8Ьс оЕ РМА яупсцеяхей йиппц сЬе геас6оп ячои!й Ье 9.7 пц, счЫсЬ ь епоицЬ со йесесс йпц1е-еору яег)иепсея сп гпапипа1сап Р)4А Ьу цоисЬегп апа!уяя. Рго1осо! 2 Капс1огп Рпгп1пц: Кайо!аЬе!1пц ог О!ЧА Ьу Ех1епьюп ог Капс1огп О!~цопис1ео1Мея 1п йе Ргеяепсе ог Мейер Ацагоье д члв)лт)Он Ог тне метноо Оевск~вео )н ркотосог 7 сап Ье паем со гайо1аЬе! Т)ХА !и 81!сеа сиГ )гош 8е18 сао тч!ГЬ!огч-ше!Г)п8-Гешрегатиге а8агоае (Ге!иЪег8 апг! У08е!8)еш 1983, 1984). Моаг оЕ йе гиагепа18 тес)шгег) Гог гЬг8 ргогосо! аге гЬе ааше аа йоге иаег! !и Ргогосо! 1.
Ноччечег, гЬе 1аЬе1108 Ьи)гег Ьаа Ьееп 81!8Ь71у шой)ген го 1пс1иг!е ип1аЬе1ег! г)Ь)ТР8 апг) гапг!ош 0118опис1еогЫе ргппега. Ассогйп8 го йе !пчеаг!8а)ог'8 пеегЬ, гЬе!аЬе11п8 геасг)оп сап Ье аааешЫег) )гош !г5 !пйчЫиа! сошропепь, аа г)еасг)Ьег! 1и Ргогосо1 1, ог )гош йе соигроясе Ьи)гег, аа г)еасг!Ъег) Ьеге. Рог йгйег дега!!8 сопсегшп8 шагепа!8 гес)п!гег! )ог ГЬе шеГЬос1 апс1 оп йе арес)6с асг!ч)гу апг! 1еп8й ог' гЬе 8епегагес) ргоЬе, р1еаяе аее гЬе !исгог!псг!ои го Ргогосо1 1.
!ч1АТЕК1АЕй СА1)Т)ОМ: Р!еаье аее Арреиг)!х 72 1ог арргорнаге Ьапг!!!па о1 гпа1ена18 гпаг!гег! гч!й <!>. Воттегв апг! йо!о6опв Р)еаае аее Аррепг)!х 7 тог согиропепга 01 агос!г ао1опопа, Ьиттега, апг1 геа8епга. О!101е 81ос!г ао1ипопа 1о йе арргорпа1е сопсеп1гапопа. Аттотит асесаГе !70 М) Орггопа!, р1еаье гее 5гер 5. Вочте ьегигп а!Ьитт !70 тВ!гпр егЬапо! Оргюпа!, р1еаге гее 5гер 5. ЕгЬ7спит Ьгот7г)е <! > 170 тВ)т)) ог Бувй СоЫ ига)пт8 ьо)иВоп <! > ХА 57ор)57огаде Ьивег 50 игМ ТипС! (рН 7.5) 50 гиМ ХаС! 5 игм ВОТА (рН 8.0) 0.5ОА 7гг)ч) ЯЭ5 9.9 9.10 СЬарсег 9: РгерагаКоп оТйатЕЕо1аЬе)етЕ ОНА аптЕ ПХА РгоБет 5х О!сеопис)еосгс)е !аЬе))пВ ЬиКег 250 шМ ТгхоС! !РН 8.0) 25 шхс МВС1| 20 шхс |П|Ь|осЬгеио! 2 шМ еасЬ оЕ йе ип!аЬе)е6 д)ЧТРа 1 М НЕРЕЯ Еаб)иасеа со РН 6.6 |чКЬ 4 тс ЫаОН) 1 шВ)пт! гапбош беохупис!еосЫе рпгпега, ях Ъааев |п 1епВЕЬ 5соге сЬе ЬиКег !и ешь аЬ|)иост ас -20'С.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
