Диссертация (1335938), страница 15
Текст из файла (страница 15)
Я был обескуражен своим будущим. ____2 . Я не интересовался деятельностью других людей . ____3 . Я чувствовал себя оторванным от других людей. ____4 . Я не чувствую себя уверенным в себе. ____5 . Я потерял интерес к еде. ____Особенности характера1 . Я был раздражительным. ____2 . Я был нетерпелив с окружающими. ____803 . Мой характер изменился. ____Самообслуживание1 . Нужна ли Вам помощь в приготовлении пищи ? ____2. Нужна ли Вам помощь при приеме пищи ? Например, при разрезании илиприготовлении пищи ? ____3 . Нужна ли Вам помощь при одевании? Например, при надевании носковили ботинок, застегивании пуговицы или молнии ? ____4 .
Нужна ли Вам помощь при принятии ванны или душа ? ____5 . Нужна ли Вам помощь в пользовании туалетом ? ____Социальная роль1. Я не выходжу так часто, как мне бы хотелось. ____2 . Я занимаюсь своим хобби или развлекаюсь меньше по времени, чем мнебы того хотелось . ____3. Я вижу своих друзей меньше, чем мне бы того хотелось. ____4.
Я занимаюсь сексом реже, чем мне бы того хотелось. ____5. Мое физическое состояние мешает моей социальной жизни. ____Мышление1. Мне трудно концентрироваться . ____2. Мне трудно запоминать вещи . ____3. Мне нужно записывать, чтобы не забыть . ____Функция верхней конечности1. испытываете ли Вы трудности при письме или печатании ? ____2. испытываете ли Вы трудности при надевании носков? ____3. испытываете ли Вы трудности при застегивании пуговиц? ____4. испытываете ли Вы трудности при застегивании молнии? ____5. испытываете ли Вы трудности при открывании банок? ____Зрение1.
Видите ли Вы телевизор настолько хорошо, чтобы получать удовольствиеот программы? ____812. испытываете ли Вы трудности при необходимости достать что-либо из-заплохого зрения? ____3. испытываете ли Вы трудности при «провожании взглядом» в однусторону? ____Работа / производительность1. испытываете ли Вы трудности при выполнении повседневной работы подому ? ____2 испытываете ли Вы трудности при завершении начатой работы? ____3. испытываете ли Вы трудности при выполнении привычной работы? ____ИТОГОВЫЙ БАЛЛ ____Трактовка тестирования по шкале SS-QOL включает рассмотрение каждогораздела с выявлением наиболее значимых ухудшение качества жизни, однакоприемлем более простой вариант, учитывающий только общую сумму баллов(прямо пропорциональна уровню качества жизни пациента).2.5.
Характеристика молекулярно-генетических исследований2.5.1. МатериалыВ работе были использованы следующие реактивы: (NH4)2SO4, MgCl2,H3BO3, ЭДТА, ПСА, бромистый этидий («Sigma»), Tween 20 («Serva», США), Trisbase, акриламид, N,N-метилен бисакриламид, ТЕМЕД (все «ICN», США), этанол(«Реахим», Россия). Дезоксинуклеозидтрифосфаты (dNTP), TaqMan-зонды иолигонуклеотидные праймеры были синтезированы в ИХБФМ СО РАН. TaqДНК-полимераза (ИХБФМ СОРАН, Россия), «Biosun» (1 ед.акт./реакц.),эндонуклеазы рестрикции («Сибэнзим», Россия), Маркер молекулярных длинpBlSK/MspI: 710, 489, 404, 328, 242, 190, 157, 147, 110, 67, 57 (ИХБФМ СО РАН).В работе были использованы буферы и растворы:1.Буфер для работы ферментов рестрикции («СибЭнзим») Blue: 10 мМTris-HCl (pH 7.6 при t = 25oC), 10 мМ MgCl2, 1 мМ DTT;822.ПЦР-буфер C35N160 (10-кратный): 650 мМ Tris-НСl (рН 8.9 при t =25oC); 160 мМ (NH4)2SO4; 0,5% Tween 20; 35 мМ MgCl2;3.ПЦР-буфер C35N240(10-кратный): 650 мМ Tris-НСl (рН 8.9 при t =25oC); 240 мМ (NH4)2SO4; 0,5% Tween 20; 35 мМ MgCl2;4.Раствор dNTP (dATP, dCTP, dGTP, dTTP): 2 мM каждый;5.Буфер для электрофореза - TBEx10: 108 г Tris base, 50 г борнойкислоты, 40 мл 0,5 М ЭДТА (pH 8,0), вода дистиллированная до 1 л;6.Буфер для нанесения образцов ДНК при электрофорезе в агарозныхгелях и ПААГ: 0,5% бромфеноловый синий, 0,5% ксилен цианол FF, 50%глицерин, в воде;7.30% раствор акриламида (30 г акриламида и 0,8 г бисакриламида на100 мл воды);8.TE (10 мM Tris, 0,5 мM ЭДТА, H2O до 1 мл);2.5.2.
Методы выделения ДНКДля молекулярно-генетического исследования взята венозная кровь путемпункции кубитальной вены. Образцы ДНК для генотипирования полученыметодомфенол-хлороформнойэкстракцииизцельнойвенознойкрови,стабилизированной 2,5% раствором ЭДТА в отношении 10:1, в полномсоответствии с протоколом.Выделение ДНК проводилось с помощью фенол-хлороформной экстракции(Bendeck M.P., 2002). Пробирки с клиническими образцами центрифугировали на14 тыс. оборотов/мин. 15 минут. Осадок ресуспендировали в 300 мкл раствора №1(100 мМ Tris HCl pH = 8,0; 10 мМ ЕДТА, 100мМ NaCl). Добавляли 50 мклраствора №2 (10% додецил сульфат натрия (SDS)) и 10 мкл протеиназы К (10мг/мл). Хорошо перемешивали и инкубировали 1 час при 55оС. Добавляли 200мкл фенола, уравновешенного ТЕ и 200 мкл хлороформа.
Интенсивноперемешивали и центрифугировали 10 мин на максимальной скорости (14т.о./мин). Верхнюю фазу переносили в чистую пробирку, не трогая нижнюю и83интерфазу. Добавляли 400 мкл хлороформа. Перемешивали и центрифугировали 5мин на максимальной скорости (14 т.о./мин). Верхнюю фазу переносили в чистуюпробирку. Добавляли 10 мкл ЛПААГ, 40 мкл 3М AcNa pH5.4, 800 мкл EtOH,тщательно перемешивали. Инкубировали ночь на –200С. Центрифугировали 15мин на максимальной скорости (14 т.о./мин).
Супернатант удаляли, к осадкудобавляли 400 мкл 75% EtOH. Инкубировали 10 мин при комнатной температуре.Отбирали супернатант, следя за тем, чтобы осадок остался в пробирке. Сушилипробирки с открытыми крышками в термостате для микропробирок при 370С втечение 15 мин. К осадку добавляли 1000 мкл ЭДТА и прогревали при 65 оС 10минут.2.5.3.
Методы ПЦР/ПДРФ диагностикиГенотипированиеоднонуклеотидныхзамен.Данныеполиморфныеварианты представляют собой нуклеотидные замены, которые могут бытьзарегистрированы по появлению или потере сайтов узнавания для ферментовэндонуклеазнойрестрикции,чтопроявляетсянаэлектрофореграммеполиморфизмом длин рестрикционных фрагментов. Полимеразную цепнуюреакцию проводили в конечном объеме 15 мкл, содержащем 650 мМ трис-HCl (рН8,9), 160 мМ сульфат аммония; 20 мМ MgCl2; 0,05% Tween 20; 2 мM dNTP; 0,5мкМ растворы олигонуклеотидных праймеров, 20-100 нг ДНК и 1 ед. Taqполимеразы. Реакцию проводили на амплификаторе «Eppendorff» с начальнойденатурацией при 95°С 3 мин, далее в течение 42 циклов с денатурацией 5 сек при95°С, отжигом 5 сек при Тотжига и элонгацией 15 сек при 72°С. Финальнаяэлонгация проводилась при 72° С 5 мин. Структуры праймеров и температура ихотжига, длины амплификационных фрагментов, эндонуклеазы рестрикции идлины получаемых фрагментов, используемые для типирования полиморфныхлокусов методом ПДРФ-анализа, представлены в таблице 8.84Таблица 8 - Структуры праймеров и температура их отжига, длиныамплификационных фрагментов, эндонуклеазы рестрикции и длины получаемыхфрагментов используемые для типирования полиморфных локусов методомПДРФ-анализаЛокусПраймерыHIF1aС1772Т,гипоксияиндуцированныйфактор 1аp22phoxC242T,цитохромb-245,альфаполипептидGTTACGTTCCTTCGATCAGTTGTGAGTAGTGGTGGCATTAGCAGTAGGaTCДлинаамплификац.фрагмента132Тотжпраймеров,оС60ДлиныЭндонурестрикцклеазаАллионныхрестрик елифрагментцииов44562108+24T83+25+24C316+64+65T380+65Kzo9IAGGACGGCCCGAACATAGGAGCTGGGCTGTTCCTTAACCCRsaIДля проведения ПДРФ-анализа полученных фрагментов ДНК, рестрикциюосуществляли следующим образом.
К амплификационной смеси добавляли 1/10объема 10-кратного буфера для рестрикции и эндонуклеазу рестрикции (1-3 ед.акт. фермента) и инкубировали 2 часа при 65˚С. Буфер для рестрикциииспользовали с учетом рекомендаций производителя эндонуклеазы рестрикции.Фермент инактивировали добавлением 1 мкл 0,5М ЭДТА.Анализ продуктов гидролиза проводили в 7% ПААГ, гель окрашивалибромистым этидием с визуализацией ДНК УФ-светом, затем фотографировали спомощью цифровой видеокамеры Vatec (Япония).852.5.4.
Генотипирование однонуклеотидных замен в режиме реальноговремени с использованием конкурирующих TaqMan-зондов,комплементарных полиморфным участкам ДНКГенотипирование однонуклеотидных замен в генах MnSOD (rs4880) и GPX1(rs1050450).Напервомэтапеисследованиябылиразработаныметодыгенотипирования однонуклеотидных замен в генах MnSOD и GPX1 с помощьюПЦР в режиме реального времени с использованием конкурирующих TaqManзондов, комплементарных полиморфным участкам ДНК.
Зонды отличаются поструктуре на один нуклеотид, соответствующий SNP (находится в центреолигонуклеотидного зонда). В реакционной смеси зонды конкурируют друг сдругом за гибридизацию с матрицей. При полной комплементарности матрицы изондагибридизациякомплементарности.будетэффективнее,чемвслучаеСледовательно, накопление флуоресцентногонеполнойсигнала,соответствующего полностью комплиментарному зонду, будет преобладать.Основным параметром, который мы учитывали для каждой из реакций,являлось соотношение значений флюоресценции (relative fluorescence unit, илиRFU) в диапазонах эмиссии красителей FAM и R6G.
Для генотипа С/С (MnSOD)интенсивность флюоресценции увеличивалась преимущественно в диапазонеFAM, при генотипе Т/Т (MnSOD) интенсивность флюоресценции увеличиваласьпреимущественно в диапазоне R6G, при гетерозиготном генотипе интенсивностьфлюоресценции увеличивалась в обоих диапазонах.а)б)86/Рисунок 2 - Кинетические кривые накопления продукта амплификации участкагена MnSOD для генотипов: а) C/T б) C/C, в) T/TПри оптимизации условий амплификации варьировали соотношениеконцентрацийзондов,температуруотжигапраймеров,составамплификационного буфера. Достоверность генотипирования подтверждаласьсеквенированием.
При оптимизации были подобранны условия, которыеиспользовались для типирования (приведены в разделе «Материалы и методы»).На рис. 2 (а, б, в) представлены результаты, полученные с помощью Real-timePCR, иллюстрирующие вид кинетических кривых для каждого из генотипов гена(графики приведены для MnSOD; остальные – подобно).
Важным критериемдостоверности генотипирования служила кластеризация генотипов в группы,строившаясянаосновепоказателейинтенсивностиотносительных единицах флюоресценции - RFU) (рис 3).флюоресценции(в87Рисунок 3 - Кластеризация образцов на основании значений RFU(MnSOD)Каждый образец амплифицировался с использованием пары праймеров идвух зондов, несущих «гаситель» на 3’-конце и разные флюоресцентныекрасители (FAM либо R6G) на 5’-конце.
Структуры праймеров и зондовприведены в таблице 1. Общий объем реакционной смеси составлял 25 мкл, смесьсодержала 40-100 нг ДНК; 300 нМ каждого праймера; по 100-200 нМ Taqmanзондов,коньюгированныхсFAMилиR6G;200мкМ-ныеdNTP,амплификационный буфер термостабильную Taq-полимеразу – 0,5 ед.акт./реакц.Структуры праймеров и зондов, используемых для генотипирования в режимереального времени методом конкурирующих TaqMan-зондов, представлены втаблице 9.Таблица 9 - Структуры праймеров и зондов, используемых для генотипирования врежиме реального времени методом конкурирующих TaqMan-зондов.ЛокусMnSODПраймеры5’-Зонды5’-R6G-88C47T,марганцеваяCTGTGCTTTCTCGTCTTCAGсупероксиддисмута 3’за5’CGTTGATGTGAGGTTCCAG3’5’GCTTCCAGACCATTGACATCGPX-1С599Т,3’глютатионперокси5’даза-1CGAGGTGGTATTTTCTGTAAGATC-3’CTGGCTCCGGTTTTGGGG-FQ-3’5’-FAMCTGGCTCCGGCTTTGGGG-RTQ-3’5’-R6GCTCAAGGGCTCAGCTGTGC-BHQ2-3’5’-FAMCTCAAGGGCCCAGCTGTGC-BHQ2-3’ПЦР проводилась в следующих условиях: начальная денатурация 3’ при96°С; затем 40 циклов, включающих денатурацию при 96°С-8”, отжиг праймерови последующую элонгацию при 60°С- 35” (каждый шаг сопровождалсярегистрациейфлюоресцентногосигналавдиапазонах,соответствующиминтервалам флюоресценции флюорофоров FAM и R6G).2.6.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
