Диссертация (1174357), страница 2
Текст из файла (страница 2)
Материалы диссертации используются в педагогическом процессе приподготовке студентов, ординаторов, аспирантов, курсантов ФУВ на кафедреакушерства и гинекологии педиатрического факультета ФГБОУ ВО «Российскийнациональныйисследовательскиймедицинскийуниверситетим.Н.И.7Пирогова» Минздрава России.Методология и методы исследования. Исследование было проведено с 2011 по2014 год в гинекологической клинике кафедры акушерства и гинекологиипедиатрическогофакультетаРоссийскогонациональногоисследовательскогомедицинского университета Минздрава России им. Н.И.
Пирогова (заведующийкафедрой − академик РАН, проф., д.м.н. Савельева Г.М.), на базе ГБУЗ ГКБ №31Департамента здравоохранения города Москвы (главный врач – Ефремова Н.М.), а также на базе кафедры молекулярной фармакологии и радиобиологии им. академикаРАМН П.В. Сергеева Российского национального исследовательского медицинскогоуниверситета Минздрава России им. Н.И. Пирогова (заведующий кафедрой – чл.-корр.РАМН, проф., д.м.н. Шимановский Н.Л.).Нами были обследованы 143 пациентки пре- и постменопаузального периодов ввозрасте старше 47 лет с пролиферативными процессами эндометрия (железистые,железисто-фиброзныеиаденоматозныеполипы,железистаяиатипическаягиперплазия, аденокарцинома высокой и умеренной степени дифференцировки),которые находились на стационарном лечении в ГБУЗ ГКБ №31 ДЗ г. Москвы исоответствовали критериям включения и исключения.
Критериями включенияпациенток в исследование явились нижеперечисленные условия: возрастной период от47 лет и старше, подозрение на наличие внутриматочной патологии по даннымпредшествующих УЗИ и обязательное согласие пациенток на участие в обследовании.Критериями исключения пациенток из исследования служили нижеперечисленныеусловия: прием гормональных препаратов (эстроген-гестагены, гестагены, агонистыгонадотропин-рилизинг-гормона, заместительная гормональная терапия, тамоксифен)втечениетрехмесяцевпередгинекологических заболеваний –обследованием,наличиесопутствующихмиома матки, размеры которой на моментобследования превышали 6-7 нед. беременности, опухоли яичников, острыевоспалительные заболевания гениталий.С учѐтом характера выявленного в ходе исследования ППЭ, обследованные намипациентки были разделены на три группы.
I группу составили 87 больных с полипамиэндометрия, их них 21 с железистыми полипами, 54 с железисто-фиброзными8полипами и 12 с аденоматозными полипами; II группу – 38 пациенток с гиперплазиейэндометрия: железистой (23) и атипической (15); IIIаденокарциномойэндометрия:группу – 18 пациенток свысокодифференцированной(3)иумереннодифференцированной (15), данные представлены на Рисунке 1.26,6%12,6%I группаII группаIII группа60,8%Рисунок 1.
Распределение обследованных пациенток по группамКлиническая часть исследования включала клинико-анамнестический анализ иинструментальные методы диагностики. Всем пациенткам при поступлении в клиникупроводилось общеклиническое (клинический анализ крови, биохимический анализкрови,гемостазиограмма),лабораторноеиинструментальноеобследование.Клиническое исследование включало тщательный сбор анамнеза, оценку жалоб ипродолжительности постменопаузы, выявление сопутствующей генитальной иэкстрагенитальной патологии, перенесенных оперативных вмешательств, измерениероста и веса больных, определение индекса массы тела по стандартной методике,оценка состояния молочных желез, гинекологическое исследование.Помимо общеклинических и гинекологического обследований нами былииспользованы инструментальные методы диагностики патологии органов малого таза– ультразвуковое исследование (УЗИ) производили на аппарате экспертного уровняVoluson 730 Expert (General Electric Kretz, USA) с использованием трансвагинальногоконвексного датчика (3,3-10,0 МГц) в режиме двух и трехмерной эхографии пообщепринятой методике.
Тщательному анализу подвергали срединное маточное эхо9(М-эхо), проводили оценку его толщины (переднезадний размер), структуры,контуров, характер включений и величины матки, эхосигналы кровотока. Так жеоценивали состояние миометрия, наличие миоматозных узлов и яичниковыхобразований, их размеры, структуру, расположение и присутствие эхосигналовкровотока.Для выявления возможного влияния гормонального профиля больных нарецепторный статус эндометрия перед оперативным вмешательством всем пациенткампроводили забор венозной крови с дальнейшим определением в плазме уровняследующих гормонов: ЛГ, ФСГ, тестостерон, пролактин, прогестерон, эстрадиол постандартной методике.После клинического, лабораторного и инструментального обследований наследующем этапе с диагностической и лечебной целью всем больным проводилигистероскопию, раздельное диагностическое выскабливание слизистой матки пообщепринятой методике с использованием эндоскопического оборудования фирмы«Karl Storz, Германия» и « Johnson & Johnson, США».
Часть зеркально удаленнойткани эндометрия использовали для гистологического исследования, остальная – дляопределения уровня экспрессии генов рецепторов эстрадиола и прогестерона.Подробное распределение больных в зависимости от гистологического вариантаудаленного пролиферативного процесса эндометрия с учетом периода жизниобследованных представлено в Таблице 1.1.10Таблица 1.1.IIIIIПолипыэндометрияIАденокарцинома Гиперплазияэндометрияэндометрия№ГруппаХарактер патологии эндометрия у пациенток в пре- и постменопаузе.N87Период жизни женщиныNВид патологии эндометрияПременопаузальныйАбс.%ПостменопаузальныйАбс.%Абс.%Железисто-фиброзный полип5437,896,34531,5Железистый полип2114,71611,253,5Аденоматозный полип128,442,885,6Железистая гиперплазия2316,1201432,1Атипическая гиперплазия1510,542,8117,7Высокодифференцированнаяаденокарцинома32,1--32,1Умереннодифференцированнаяаденокарцинома1510,521,4139,13818В ткани эндометрия определяли наличие и уровни экспрессии генов мембранных(mER, mPR и PGRmC1) и ядерных (ERα и ERβ, PR-А и PR-В) рецепторов эстрадиола ипрогестерона соответственно, а так же ядерного белка р53.
Выделение мРНК из тканиэндометрия, проведение реакции обратной транскрипции и анализ количества кДНКпроводили стандартными методами полимеразной цепной реакцией в реальномвремени (iCycler iQ real-time PCR, «BioRad», Германия). В качестве гена сравненияиспользовали ген GAPDH (глицеральдегид-фосфатдегидрогеназа).11Используемые реактивы:Физиологический раствор, 0,9% раствор натрия хлорида («Биосинтез»,Россия);Раствор фиколла, ρ=1,077 г/см3 («ПанЭко», Россия);Реактивы набора "Рибо-преп" (ФБУН Центральный НИИ эпидемиологииРоспотребнадзора, Россия);Реактивы набора "Реверта-L" (ФБУН Центральный НИИ эпидемиологииРоспотребнадзора, Россия);Реактивы "Реакционная смесь 2,5х для проведения ПЦР-РВ в присутствииSYBRGreenI" («Синтол», Россия);Праймеры для полимеразной цепной реакции («Синтол», Россия);Среда DMEM с глутамином и гентамицином («ПанЭко», Россия);Используемое оборудование:Центрифуга РС-6 («ТНК Дастан», Киргизская Республика);Центрифужные пробирки из полистирола на 10 мл («F.L.
Medical», Италия);Камера Горяева;Пробирки микроцентрифужные типа Эппендорф стерильные на 1,5 и 0,2 мл;Автоматические дозаторы Thermo на 1000, 200 и 10 мкл («Ленпипет»,Россия);Насадки для микропипеток на 1000, 200 и 10 мкл с/без аэрозольногобарьера;Вортекс MicrospinFV-2400 («BioSan», Латвия);Микроцентрифуга Eppendorfminispin («Eppendorf», Германия);Термостат Гном («ДНК-Технология», Россия);Амплификатор iCycleriQ5 real-timePCR («BioRad», Германия);Ламинарный бокс («LS», Россия).Выделение РНК из ткани эндометрия проводили методом преципитации спомощьюнабораготовыхреагентов"Рибо-преп"(ФБУНЦентральныйэпидемиологии Роспотребнадзора, Россия) согласно инструкции производителя.НИИ12Получение кДНК на матрице мРНК осуществляли реакцией обратнойтранскрипции с использованием комплекта готовых реагентов "Реверта-L" (ФБУНЦентральный НИИ эпидемиологии Роспотребнадзора, Россия) согласно инструкциипроизводителя.Для реакции полимеразной цепной реакции в реальном времени использовалинабор реактивов для ПЦР "Реакционная смесь 2,5х для проведения ПЦР-РВ вприсутствии SYBRGreenI" («Синтол», Россия) на приборе iCycleriQ5 real-timePCR(«BioRad», Германия).
В качестве контрольного гена использовали ген GAPDH.Для постановки 12 реакций с праймерами для одного гена в 1,5 млмикроцентрифужные пробирки добавляли 117 мкл H2Oдд, 117 мкл MIX-смеси, 13 мклMgCl2, перемешивали и отбирали 19 мкл полученной смеси в 200 мкл микропробиркидля первого контроля. Затем в полученную смесь вносили по 24 мкл прямого иобратного праймеров (up и low), перемешивали и отбирали 23 мкл полученной смеси в200 мкл микропробирки для второго контроля. Последовательности нуклеотидов виспользуемых праймерах представлены в Таблице 1.2 («Синтол», Россия).Рисунок 2.Схема полимеразной цепная реакция с обратной транскриптазой.Примечание: RNA – РНК, primers – праймеры, reverse transcriptase – обратная транскриптаза,DNA polymerase – ДНК-полимераза, buffer reagents – буферные реагенты, cDNA – кДНК, reversetranscription – обратная транскрипция.13Таблица 1.2.Последовательность синтетических олигонуклеотидов для исследованияэкспрессии генов стероидных рецепторов методом RT-PCR[http://www.ncbi.nlm.nih.gov/protein/].Наименование5'-3' последовательность (up/low)mERAGGGACAAGCTGAGGCTGTA /GTCTACACGGCACTGCTGAAPR-AGGTCTACCCGCCCTATCTCA /GGCTTGGCTTTCATTTGGAAARGCCTTGCTCTCTAGCCTCAA /TGAATGACAGCCATCTGGTCGRCAATCAAGTGCAAACCTGCTGT/TTTCCTCTGAGTTACACAGGEGAPDHGAAGGTGAAGGTCGGAGT /GAAGATGGTGATGGGATTTCCПримечание: mER – мембранный рецептор эстрадиола, PR-A - рецептор прогестерона типаА, GR - рецептор глюкокортикоидов, AR – рецептор андрогенов, GAPDH - ген сравнения.После приготовления готовой реакционной смеси ее вносили по 23 мкл в 200мкл микропробирки, добавляли по 2 мкл кДНК, тщательно перемешивали и ставилив прибор iCycler iQ5 real-time PCR («BioRad», Германия).
Затем запускалипрограмму амплификации и плавления (Рисунок 3).14Рисунок 3.Схема полимеразной цепная реакция с обратной транскриптазой.Примечание: RNA – РНК, primers – праймеры, reverse transcriptase – обратная транскриптаза,DNA polymerase – ДНК-полимераза, buffer reagents – буферные реагенты, cDNA – кДНК, reversetranscription – обратная транскрипция.1. Программа амплификации:а) 1 цикл: 10:00 мин – 950С;б) 2-40 циклы: 00:15 мин – 950С, 01:00 мин – 600С.Врезультатеэкспериментаполучаликривыеамплификациикоторыепозволяли определить численные значения уровней экспрессии изучаемых генов(Рисунок 4).Рисунок 4.Пример графиков накопления продуктов амплификации для реакций содинаковым начальным количеством матричной ДНК.15Примечание: ось ординат – интенсивность флуоресценции (у.е.), ось абсцисс – количествоциклов ПЦР.2.
Программа плавления (Рисунок 5):a) 1 цикл: 01:00 мин – 950C;б) 2 цикл: 01:00 мин – 550С; в) 3-84 цикл: 00:10 мин – 550СРисунок 5.Кривые плавления ампликонов после проведения RT-PCR с праймерами BTUB9 xBTUB2. (Мустафина Г.Р., 2010).Примечание: ось ординат – интенсивность флуоресценции (у.е.), ось абсцисс – температураплавления (°С).Для оценки числа копий мРНК применяли ΔСt-метод по формуле 1/2-∆Ct (длявыявления различий) и 2-∆∆Ct (для определения кратности разницы), где Ct –пороговый цикл (threshold cycle), соответствующий числу циклов амплификации,необходимых для достижения порогового значения флуоресценции, ∆Сt – разницамежду пороговым циклом исследуемого гена и геном сравнения (GAPDH), ∆∆Сt –сравнение значений ΔCt контрольного и опытного образцов. Относительный уровеньмРНК представлен в виде относительных единиц (о.е., 1/2-∆Ct).Статистическую обработку результатов проводили с использованием программпакета приложений Microsoft Office и программы GraphPad Prism 6.0.
Результатыпредставили в виде среднего значения (М), медианы (Me) и стандартной ошибки (SE).Для проверки гипотезы о принадлежности наблюдаемой выборки нормальному закону16распределенияиспользоваликритерийКолмогорова-Смирнова.Проверкуоднородности исследуемых групп осуществляли при помощи критерия хи-квадрат,оценку достоверности различий между исследуемыми признаками проводили сиспользованием непараметрических методов статистики с использованием W –критерия Вилкоксона, U – критерия Манна-Уитни. При проведении корреляционногоанализа связи между параметрами внутри одной выборки использовали коэффициентранговойкорреляцииСпирмена.Разницамеждузначениямисравниваемыхпоказателей считалась вероятной при р≤0,05.Дизайнобследованиябольныхвзависимостипринадлежности к группе представлен на Рисунке 6.отпредварительной17Рисунок 6.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
