Диссертация (1174269), страница 13
Текст из файла (страница 13)
На этом основании считаем возможнымповысить класс патогенности для замен, выявленных у пациентов с НМЛЖ всочетании с гипертрофией миокарда. Для двух генетических вариантов класспатогенности был повышен с III до IV (вариант с неустановленным клиническим81значением → вероятно патогенный), еще для одного генетического варианта – сIV до V (вероятно патогенный → патогенный).Рисунок 10R. Walsh et al., 2017 [47], ред. В иллюстрации использованырезультаты анализа замены p.K397E в гене MYH7 с помощью ресурса CardioClassifier. EF – этиологический индекс, доля пациентов, у которых генетическийвариант вызвал заболевание.Генетическиеварианты,расположенныевнутрикластера,вариантыремоделирования миокарда у пациентов-носителей и классы патогенностигенетических вариантов после переоценки представлены в таблице 14.Генетический вариант p.R237W был ранее описан у пациента с семейнойформой дилатационной кардиомиопатии [80] и охарактеризован как возможнопатогенный, однако после переоценки генетических вариантов, выявленных вкогорте пациентов с дилатационной кардиомиопатией [88], был признанвариантом с неустановленным клиническим значением.
По результатам нашегоанализа, генетический вариант p.R237W также можно охарактеризовать каквариант с неустановленным клиническим значением.82Таблица 14. Варианты ремоделирования миокарда у пациентов сгенетическими вариантами, расположенными внутри кластера№Генетический Вариант ремоделирования Класс патогенностивариантмиокардагенетическоговарианта1p.G181RНМЛЖ + дилатацияp.R237WНМЛЖ+дисплазиядиагноз).3p.K397EНМЛЖ + гипетрофияIV → V4p.Q419KИзолированный НМЛЖIII5p.K837MНМЛЖ + гипетрофияIII → IVp.E855delНМЛЖ + гипертрофиясочетании с дилатацией26IIIаритмогенная III(вероятныйв III → IVВ гене MYH7 было обнаружено 2 делеции: c.2563_2656delGAG (p.E855del) игенетический вариант c.5754_5756 del CAA (p.N1918del).
Обе делеции неприводят к сдвигу рамки считывания и образованию преждевременного стопкодона.Делеция c.2563_2656delGAG (p.E855del) была выявлена у пробандаLVNC68 с некомпактным миокардом левого желудочка в сочетании с ГКМП;данный генетический вариант ранее был описан и зарегистрирован в базе данныхClinVar как вероятно патогенный (rs730880887). Семейный анамнез пробандаLVNC68 был отягощен по кардиомиопатиям, однако образцы ДНК родителейпробанда LVNC68 были не доступны для анализа. В отсутствии данных осегрегации генетического варианта в семье и данных функциональныхисследований генетический вариант c.2563_2656delGAG (p.E855del) можноотнести только к III классу патогенности (неустановленное клиническоезначение),однако,учитываярасположениегенетическоговарианта83c.2563_2656delGAG (p.E855del) внутри кластера мутаций и наличие у пробандаLVNC68 гипертрофии, мы считаем возможным отнести этот генетическийвариант к IV классу патогенности.Генетический вариант c.5754_5756delCAA (p.N1918del) приводит к делецииаминокислоты аспарагина в положении 1918 и к образованию укороченнойформы белка.
Данный генетический вариант лежит вне описанного кластерамутаций.В отсутствии данных сегрегационного анализа и функциональныхисследований, генетический вариант c.5754_5756delCAA (p.N1918del)можноотнести только к III классу патогенности (неустановленное клиническоезначение).3.3.2.1. Оценка влияния генетического варианта c.5655+5G>C насплайсингДля одного (6,7%) генетического варианта в гене MYH7 по результатамоценки с помощью программ-предикторов было обнаружено потенциальноевлияние на сплайсинг. Генетический вариант c.5655+5G>C был обнаружен в ходесеквенирования экзома у пробанда NMD14 II-1 с задержкой физическогоразвития, диффузной мышечной гипотонией, дилатацией камер сердца инекомпактным миокардом ЛЖ.
Для семьи NMD14 был выполнен каскадныйсемейный скрининг. В образцах ДНК родителей пробанда генетический вариантc.5655+5G>Cобнаруженнебыл,такимобразом,былоустановленопроисхождение генетического варианта de novo . Родословная семьи NMD14 ирезультаты каскадного семейного скрининга показаны на рисунке 11.84Рисунок 11 Родословная семьи NMD14. Римскими цифрами обозначеныпоколения семьи, арабскими – члены семьи внутри одного поколения.Пробанд указан красной стрелкой.С целью оценки влияния генетического варианта на сплайсинг пациентубыло проведено секвенирование кДНК, полученной из тотальной мРНКмышечной ткани.Пациенту была выполнена биопсия четырехглавой мышцы бедра.Вкачестве контрольного образца мышечной ткани был получен биоптатчетырехглавой мышцы бедра отца пациента (не-носитель генетического вариантаc.5655+5G>C).
Из полученных биоптатов была выделена тотальная РНК и затемметодом ОТ-ПЦР получена кДНК; кДНК секвенировали методом прямогоавтоматического секвенирования по Сенгеру.На рис. 12 показан фрагмент электрофореза в агарозоном геле кДНКпробанда и его отца (контрольный образец). Образец пробанда в ходеэлектрофореза разделился на две полосы (на рисунке показаны чернымигоризонтальными стрелками). Обе полосы были вырезаны из агарозного геля иотсеквенированы методом прямого автоматического секвенирования методомСенгера. В ходе секвенирования полосы, длина которой соответствоваланормальнойдлинеампликона,полученанормальнаягомозиготная85последовательность экзонов 37-39 (на рисунке не показана). При секвенированииполосы,длинакоторойбыламеньшенормы,полученагомозиготнаяпоследовательность экзонов 37 и 39, с утратой последовательности экзона 38.Хроматограмма прямого автоматического рисунке 12.
Таким образом, порезультатам анализа кДНК у пробанда выявлена делеция 38 экзона гена MYH7 вгетерозиготном состоянии; в контрольном образце кДНК делеция 38 экзона генаMYH7 не обнаружена.Таким образом, генетический вариант c.5655+5G>Cприводит к потередонорного сайта сплайсинга. С учетом данных каскадного семейного скрининга ирезультатов анализа кДНК генетический вариант c.5655+5G>C был отнесен к Vклассу патогенности (патогенный).Рисунок 12.
А - Электрофорез в агарозном 2% геле продуктов ОТ-ПЦРфрагментов гена MYH7 пробанда (лунка 3) и его отца (лунка 2). В образцепробандавидныдвафрагментасразнойэлектрофоретическойподвижностью; лунка 1 – маркер длин фрагментов. В - фрагментхроматограммы прямого секвенирования по Сенгеру кДНК пробанда (генMYH7). Стрелкой показана граница между экзонами с утратой экзона 38.863.3.3. Результаты молекулярно-генетического анализа гена MYBPC3 упациентов с синдромом некомпактного миокарда левого желудочкаИз числа выявленных в гене MYBPC3 генетических вариантов 8 оказалисьпатогенными или вариантами с неустановленным клиническим значением.Данные генетические варианты были выявлены в 10 неродственных семьях(таблица 14). Нумерация экзонов и аминокислот представлена в соответствии странскриптом NM_000256.3.Всеперечисленныегенетическиевариантыбыливыявленывгетерозиготном состоянии.
Распределение генетических вариантов внутри генапредставлено на рисунке 13.Генетические варианты, выявленные впервые,показаны красным цветом.Таблица 15. Локализация в гене и наличие информации в базах данных длягенетических вариантов, выявленных в гене MYBPC3 у пациентов с СНМЛЖ№НуклеотиднаязаменаИзменениебелкаЭкзонЧастота (б\д СсылкиgnomAD)1c.557C>Tp.P186L54,514e-5rs7275032162c.1037G>Ap.R346H12н/дrs3975158833c.1297G>Ap.A433T14н/дновый4c.2162C>Tp.T721I224.076e-6rs12938443385c.2217G>Ap.E739K224.015e-6CM084891(Б/Д HGMD)6c.3143G>Ap.R1048H282.482e-5rs7690180517c.3642G>Ap.W1214*32н/дrs3687659498c.3697C>Tp.Q1233*328.024e-6rs39751603787Рисунок 13.
Распределение генетических вариантов в гене MYBPC3.Из восьми перечисленных генетических вариантов два были выявленывпервые.Оценка частоты остальных генетических вариантов проводилась наоснове данных базы GnomAD.Был выполнен анализ всех миссенс-замен сиспользованием ресурсов PolyPhen2, SIFT, MutationTaster.
Также все миссенсзамены были проанализированы на предмет возможного влияния на сплайсинг спомощью ресурса NetGene2. С целью оценки возможного клинического значениявсе генетические варианты были охарактеризованы согласно рекомендациямACMG (2015) [77] и Руководства по интерпретации данных, полученныхметодами массового параллельного секвенирования [73]. Результаты анализапредставлены в таблице 16.Извосьмиобнаруженныхгенетическихвариантовшестьбыликлассифицированы как генетические варианты с неустановленным клиническимзначением, 1 – как вероятно патогенный генетический вариант и 1 – какпатогенный генетический вариант. Из восьми генетических вариантов два (25%)были обнаружены впервые.Два генетических варианта были обнаружены более чем в одной семье.Миссенс-вариант p.R346H наблюдался в двух неродственных семьях, нонсенсвариант p.Q1233* обнаружен в 4 неродственных семьях.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
