Диссертация (1174193), страница 19
Текст из файла (страница 19)
Мы наблюдаем, что кривая зависимости КИ от времени достигла максимума. В этовремя.После этого процессы гибели клеток преобладают над процессами пролиферации.Значение КИ будет постепенно уменьшаться,.Таким образом, под “временем, через которое клетки начинают погибать” мы понимаемне время начала гибели первых клеток, что не является важной информацией, а время, когданаступает баланс между процессами гибели клеток и пролиферации клеток, после чегопроцессы гибели клеток начинают преобладать над процессами пролиферации.85Данные рассуждения помогают объяснить необходимость замены среды на свежую придобавлении химиопрепаратов.
Если этого не делать, то оставшийся в среде Shh или DMSO могоказывать дополнительное стимулирующее воздействие на пролиферацию, что изменило бывремя, когда процессы пролиферации и гибели клеток сравниваются. А оставшийся в средециклопамин оказывал бы дополнительный цитотоксический НН сигналинг-опосредованныйэффект, что уменьшило бы интервал времени, когда процессы гибели клеток и пролиферациисравниваются.В отличие от работ, описанных в мировой литературе, наша методика позволяет оценитьнепосредственное влияние сигнального пути на чувствительность клеток к химиопрепаратам. Вто время как применение колориметрических методов не позволяет разграничить влияниесигнального пути в отдельности на пролиферацию и химиорезистентность [95].Помимо оценки времени, через которое начинали погибать клетки, мы предположили, чтоскорость гибели клеток (параметр, когда процессы гибели начинают преобладать надпроцессами пролиферации) также может оказаться информативным.
Но мы пришли к выводу,что на данный параметр влияет концентрация химиопрепарата (рис. 18), но не предварительноекультивирование клеток с ингибитором или активатором НН сигнального пути.В исследовании была взята линия глиомы U-251 MG, в качестве контроля взята культураастроцитов. Линия глиомы U-87 MG была исключена из исследования, так как при добавлениихимиотерапевтических препаратов наблюдалось аномальное изменение КИ, возможно,обусловленное изменением клеточной морфологии и, как следствие, изменением площадисоприкосновения клеток и поверхности микроэлектродов.Мы показали, что добавление циклопамина приводит к тому, что клетки глиомы линии U251 MG после внесения химиотерапевтических препаратов (цисплатин, темозоломид идоксорубицин) начинают погибать раньше, чем контрольные клетки, предварительнокультивированные только с растворителем DMSO.
Другими словами, культивирование клеток сциклопаминомприводиткувеличениюхимиочувствительностиилиуменьшениюхимиорезистентности к используемым препаратам.Клетки линии U-251 MG, предварительно культивируемые с циклопамином, начиналипогибать через 16,57 часов после внесения цисплатина, что в 1,65 раза меньше чем контрольныеклетки, предварительно культивированные с DMSO (27,41 часов). При внесении темозоломидаи доксорубицина время, через которое начинали погибать клетки оказалось в 1,23 и 1,44 разменьше, соответственно. Разное время начала гибели клеток объясняется как различием86механизмов химиорезистентности к разным препаратам, так и влиянием HH пути на этимеханизмы.Внесение лиганда Shh увеличивало период времени, через который начинали погибатьклетки линии U-251 MG после внесения цисплатина и доксорубицина, при сравнении сконтрольными клетками.
Но разница отсутствовала для темозоломида. Это можно объяснитьтем, что НН сигналинг в разной степени влияет на механизмы резистентности к разнымхимиотерапевтическим препаратам и механизмы репарации поврежденной ДНК [176].Наклеткикультурыастроцитовчеловекапредварительноекультивированиесциклопамином и Shh не оказывало аналогичных эффектов.При анализе полученных результатов могут появиться мысли, что разное время гибеликлеток линии U-251 MG, предварительно культивированных с циклопамином и DMSO или Shhи культуральной средой, может быть обусловлено тем, что после смены среды на свежую безданных веществ сохраняется эффект от первоначального культивирования клеток с даннымивеществами.
То есть после устранения циклопамина, молекулярные изменения в клетках неустраняются так быстро и продолжают влиять на снижение пролиферации. А после устраненияDMSO или Shh какое-то время процессы пролиферации повышены.В дополнительных экспериментах было показано, что замена среды у клеток линии U251 MG, росших в присутствии 0,2% DMSO, на среду без DMSO приводила к дальнейшемуувеличению КИ (к дальнейшему росту клеток), но скорость клеточной пролиферации ()была ниже, чем в контроле, где клетки продолжали расти без замены среды с 0,2% DMSO (рис.21). А замена среды у клеток U-251 MG, росших при концентрации циклопамина 5 мкМ и 10мкМ, на среду без циклопамина приводила к последующему увеличению КИ и увеличениюскорости изменения КИ по времени () в сравнении с контролем, где клетки продолжалирасти без замены среды (рис.
21). В первой серии экспериментов мы вправе под параметромподразумевать скорость клеточной пролиферации. В экспериментах с циклопамином правильнописать скорость изменения КИ по времени, так как циклопамин влияет на пролиферацию иоказывает НН сигналинг-опосредованный цитотоксический эффект (пусть и в меньшейстепени), что влияет на.Так как циклопамин разведен в DMSO, то при смене среды с циклопамином на свежуюсреду наблюдается два процесса. Первый процесс связан с устранением DMSO. Из первогоэксперимента понятно, что устранение DMSO приводит к дальнейшему росту клеток с87увеличением КИ, но скорость роста оказывается ниже, чем в контроле, где не производиласьзамена DMSO.
Из второго дополнительного эксперимента становится ясно, что устранениециклопамина вместе с DMSO приводит как к дальнейшему увеличению КИ, так и увеличениюскорости изменения КИ по времени (). Несмотря на ожидаемое снижениеустранения DMSO, мы наблюдаем увеличениеувеличениюиз-за. То есть устранение циклопамина приводит к, которое даже нивелирует наблюдаемое снижениевследствие устраненияDMSO. Все это свидетельствует в пользу того, что при смене среды первоначальный эффектциклопамина на клетки не сохраняется. В отсутствие циклопамина наблюдается увеличение КИи, которое может быть связано, как с увеличением пролиферации, так и с уменьшение ННсигналинг-опосредованного цитотоксического действия циклопамина.Вернемся к экспериментам с оценкой времени начала гибели клеток.
С одной стороны, мыисследуем клетки, предварительно культивированные с циклопамином, разведенным в DMSO,с другой стороны, контрольные клетки, предварительно культивированные с DMSO. Призамене среды на свежую с химиотерапевтическим препаратом мы вносим изменения. Кодинаковым изменениям относится то, что испытуемые и контрольные клетки получают новуюсреду, что стимулирует процессы пролиферации за счет появления свежей сыворотки и свежихкомпонентов среды. Также испытуемые и контрольные клетки перестают расти в присутствииDMSO, что сказывается на некотором общем снижении. И наконец, отличие заключается втом, что только испытуемые клетки перестают расти в присутствии циклопамина, что должноприводить к повышению, в отличие от контроля.
Также испытуемые и контрольные клеткиполучают одинаковую концентрацию химиотерапевтического препарата.Как было описано выше, на изменение КИ с одной стороны влияют процессыпролиферации, а с другой стороны влияют процессы гибели клеток. Так как единственнымотличием, влияющим на пролиферацию, является устранение циклопамина в испытуемыхклетках, что приводит к увеличению КИ и, то ожидаемо, что процессы пролиферациидолжны сравнятся с процессами гибели клеток позже, чем в контрольных образцах, чтоприведет к позднему началу гибели клеток.
Однако, мы наблюдаем обратный эффект, когдаклетки, росшие в присутствии циклопамина начинают погибать раньше, чем контрольныеклетки, росшие в присутствии DMSO. Данное несоответствие объясняется тем, что циклопаминповышает чувствительность клеток к химиотерапевтическим препаратам, вследствие чего,клетки, росшие в присутствии циклопамина, начинают погибать раньше, чем контрольныеклетки.88Мы считаем, что смена среды на новую без циклопамина и DMSO в меньшей степенивлияет на изменение КИ, чем внесение химиотерапевтического препарата. При добавлениихимиотерапевтического препарата, последний практически сразу начинает проникать в клеткии оказывать повреждающее воздействие на ДНК.
Повреждение ДНК в свою очередь ведет как кявлениям апоптоза и клеточной гибели, так и к замедлениям процессов клеточнойпролиферации. Как уже было сказано, так как в случае предварительного культивированияклеток с циклопамином гибель начинается раньше, чем в контроле, мы сделали вывод ововлечении НН сигналинга в процессы химиорезистентности.Для того, чтобы понять, как сигнальный путь НН оказывает воздействие начувствительность клеток к химиотерапевтическим препаратам, мы рассмотрим от чего зависитповреждающий эффект химиотерапевтических препаратов. Повреждающий эффект зависит отконцентрации внесенного препарата, времени культивирования с препаратом, скоростипроникновения препарата в клетки и от механизмов повреждения ДНК и способов ихустранения.
Чем больше препарата внесено, чем выше скорость проникновения в клетки, чемактивнее препарат осуществляет повреждающее действие и чем медленнее работаютмеханизмы репарации, тем быстрее наблюдается цитотоксический эффект, тем быстреепогибают клетки. Чем быстрее погибают клетки, тем быстрее процессы пролиферациисравняются с процессам клеточной гибели, и тем раньше наступит момент, когда= 0.В испытуемых и контрольных клетках применялась одинаковая концентрация препаратов.Различия могли наблюдаться только в скорости проникновения препаратов в клетки и скоростирепарации поврежденных молекул ДНК.
Гибель клеток, предварительно культивированных сциклопамином, могла начинаться раньше из-за того, что химиотерапевтические препаратыактивнее проникали в клетки, а репарация повреждений ДНК осуществлялась медленнее, чтосвязано с ингибированием сигнального пути НН.В литературе отмечается, что НН сигналинг стимулирует появление ABC переносчиков наклеточных мембранах опухолевых клеток и увеличивает процессы репарации поврежденнойДНК, что увеличивает химиорезистентность клеток. При ингибировании НН сигнального путиотмечается снижение данных процессов [186, 206, 263].Другая часть экспериментов по изучению влияния НН сигнального пути нахимиорезистентность была связана с предварительной активацией сигналинга при помощилиганда Shh.
Мы не стали в дополнительных исследованиях выяснять, как на КИ влияет сменасреды с Shh на свежую среду. Нам бы пришлось проводить дополнительные эксперименты сповторным добавление Shh как к клеткам росшим с лигандом, так и без него. Это потребовало89бы дополнительной траты лиганда Shh и плашек с золотыми микроэлектродами. К тому же Shhявляется лигандом и по истечении двух суток он либо истощится, либо деградирует, поэтомумы предположили, что влияние лиганда Shh на дальнейшую пролиферацию после смены средыминимальное.Это только наши предположения. Реальное доказательство того, что после смены средывлияние Shh на дальнейшую пролиферацию клеток незначительно, мы получили припроведении экспериментов с клетками культуры астроцитов человека.При предварительном культивировании клеток культуры астроцитов с Shh наблюдалосьповышение клеточной пролиферации в сравнении с контролем, но при этом время началагибели клеток при добавлении испытуемых химиотерапевтических препаратов достоверно неотличалось (рис.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
