Диссертация (1174193), страница 15
Текст из файла (страница 15)
Перед внесением реактивов клетки культурыастроцитов человека и линии U-251 MG росли в течение 50 часов, а клетки линии U-87 MG втечение 60 часов. Это обусловлено тем, что значения КИ при использовании методикиизмерения электрического импеданса для клеток линии U-87 MG оценивали на 60-ый часисследования.Для культуры клеток астроцитов человека в контрольном образце с добавлением 0,2%DMSO количество погибших клеток составило 2,41±0,32%, а количество апоптотическихклеток 6,37±1,99%. В присутствии 5 мкМ циклопамина процент погибших и апоптотических66клеток составил 1,97±0,87% и 3,39±1,59%, соответственно, что достоверно не отличается отконтроля с DMSO.
В присутствии 10 мкМ циклопамина процент погибших и апоптотическихклеток составил 2,58±0,93% и 4,70±1,63%, соответственно, что также достоверно не отличаетсяот контроля с DMSO и образцами с 5 мкМ циклопамина (рис. 17).В присутствии 20 мкМ циклопамина только на 30-40% площади лунок визуальноотмечались клетки, прикрепленные к пластику (визуально сравнивалось с контролем с 0,4%DMSO).
В снятых с пластика клетках (без погибших клеток, плавающих в культуральной среде)процентпогибшихиапоптотическихклетоксоставил12,96±2,59%и9,06±1,67%,соответственно, что достоверно отличается от контроля с 0,4% DMSO (1,52±0,38% и4,46±1,91%) (рис. 17).Таким образом, циклопамин в концентрации 20 мкМ оказывает цитотоксическое действиена клетки культуры астроцитов человека; в концентрации 5 и 10 мкМ циклопамин не токсичендля этих клеток.Для клеток линии U-251 MG в контрольном образце с добавлением 0,2% DMSO процентпогибших клеток составил 2,68±0,72%, а процент апоптотических клеток 4,45±0,57%. Вприсутствии 5 мкМ циклопамина процент погибших и апоптотических клеток составил7,01±0,60% и 7,70±0,55%, соответственно, что достоверно отличается от контроля с DMSO.
Вприсутствии 10 мкМ циклопамина процент погибших и апоптотических клеток составил8,43±0,82% и 10,64±2,10%, соответственно, что также достоверно отличается от контроля сDMSO. Однако достоверные различия процентов погибших и апоптотических клеток междуобразцами с 5 и 10 мкМ циклопамина отсутствуют (рис. 17). Коэффициент корреляцииСпирмена r для процента погибших клеток = 0,90. Коэффициент корреляции Спирмена r дляпроцента апоптотических клеток = 0,95.Для клеток линии U-87 MG в контрольном образце с добавлением 1,6% DMSO процентпогибших клеток составил 3,95±0,64%, а процент апоптотических клеток 5,68±0,58%.
Вприсутствии 5 мкМ циклопамина процент погибших и апоптотических клеток составил7,37±0,50% и 8,33±0,63%, соответственно, что достоверно отличается от контроля с DMSO. Вприсутствии 10 мкМ циклопамина процент погибших и апоптотических клеток составил9,38±0,64% и 12,45±1,18%, соответственно, что также достоверно отличается от контроля сDMSO и образцами с 5 мкМ циклопамина (рис. 17). Коэффициент корреляции Спирмена r дляпроцента погибших клеток = 0,95. Коэффициент корреляции Спирмена r для процентаапоптотических клеток = 0,95.67Таким образом, добавление 5 и 10 мкМ циклопамина оказывает цитотоксическое действиена клетки линии U-251 MG и U-87 MG.Рисунок 17.
Гистограммы, отображающие процент погибших клеток (а) и клеток всостоянии апоптоза (б). Планки погрешностей отображают стандартное отклонение.Звездочкой отмечены не отличающиеся друг от друга выборки.3.4 Изучение влияния сигнального пути Hedgehog на химиорезистентность клетокПодбор оптимальной концентрации химиотерапевтических препаратовИзвестно,чтохимиотерапевтическиепрепаратыимеютиндивидуальныйспектртоксичности по отношению как к разным типам клеток живого организма, так и к разнымкультурам клеток.
Для каждой культуры клеток, оценивая зависимость цитотоксичности отконцентрацииисследуемыхвеществ,былиподобраныоптимальныеконцентрациихимиотерапевтических препаратов. Под оптимальной концентрацией мы понимали такую, прикоторой значение КИ уменьшалось не сразу, а через некоторое время после внесения препарата,что также определялось индивидуально для препарата и культуры клеток.
Нам былонеобходимо, чтобы от момента внесения препарата до начала гибели клеток проходилодостаточно времени, чтобы достоверно определять влияет ли активация или ингибированиесигнального пути на чувствительность клеток к химиотерапевтическим препаратам. В случаевысоких концентраций используемых препаратов, когда клетки начинают погибать оченьбыстро, нам бы было сложнее выявлять достоверные отличия между экспериментальными иконтрольными образцами.68Цисплатин в конечных концентрациях от 3,13 мкМ до 200 мкМ вносили на вторые суткиот начала эксперимента (43 часа). При концентрации 12,5 мкМ гибель клеток наступает через16 часов после внесения препарата, по сравнению с 1,5 часами при концентрации 200 мкМ.
Длялинии глиобластомы U-251 MG для дальнейших исследований выбрали концентрациюцисплатина 12,5 мкМ (рис. 18).Рисунок 18. Зависимость КИ от времени культивирования и концентрациицисплатина для культуры клеток глиомы линии U-251 MG.Выбранная концентрация цисплатина для астроцитов составила 50 мкМ.
Длятемозоломида концентрация составила 5 мМ для линии U-251 MG и астроцитов человека.Оптимальная концентрация доксорубицина – 8 мкМ и 1 мкМ для линии U-251 MG иастроцитов человека, соответственно (данные не представлены).Изучение цитотоксического действия цисплатина на клетки после их предварительногокультивирования с циклопамином и лигандом ShhПостановка эксперимента подробно описана в разделе материалы и методы, здесь же мынапоминаем, что клетки в течение 2-х суток предварительно культивировались с циклопаминомили лигандом Shh, после чего среду меняли на среду с химиотерапевтическим препаратом, иоценивали время начала гибели клеток в сравнении с контрольными образцами.При внесении (на 47-ой час) 12,5 мкМ цисплатина к клеткам глиобластомы человекалинии U-251 MG, прединкубированных на среде с 5 и 10 мкМ циклопамина, гибель клетокначиналась через 64,82±1,01 и 63,57±0,58 часа после начала культивирования, соответственно,что достоверно не отличается.
Гибель клеток в контроле (0,2% DMSO) начиналась с 74,41±0,3569часа эксперимента, что достоверно отличается от данных, полученных для клеток,предварительно культивированных с циклопамином (рис. 19 а, 20 а). Коэффициент корреляцииСпирмена r для времени начала гибели клеток = -0,85. В экспериментальных образцах, гдеклетки предварительно культивировали с 10 мкМ циклопамина, гибель клеток начиналась на16,57 час после внесения цисплатина, что в 1,65 раза меньше чем в контроле (27,41 час отмомента внесения цисплатина).
Гибель клеток, предварительно культивированных с 3 мкг/млShh начиналась через 69,49±1,01 часов, что достоверно отличается от контроля, где клеткикультивировались только на ростовой среде (66,41±1,26 час от начала эксперимента) (рис. 19 б,20 а).Рисунок 19. Зависимость клеточного индекса от времени до и после внесенияцисплатина для клеток линии U-251 MG (12,5 мкМ цисплатина), культивированных сциклопамином (а) и Shh (б) и клеток культуры астроцитов (50 мкМ цисплатина),культивированных с циклопамином (в) и Shh (г). Стрелками указано время внесенияцисплатина.
Кривые 1 на графиках а, в – контрольные кривые без внесения цисплатина.При внесении (на 48-ой час) 50 мкМ цисплатина к клеткам культуры астроцитов,предварительно растущим на среде с 5 и 10 мкМ циклопамина, гибель клеток начиналась через59,97±0,72 и 60,38±0,72 часа после начала культивирования, соответственно, что достоверно не70отличается. Гибель клеток в контроле (0,2% DMSO) начиналась через 60,17±0,90 час, чтодостовернонеотличаетсяотданных,полученныхдляклеток,предварительнокультивированных с ингибитором сигнального пути циклопамином (рис. 19 в, 20 б).Предварительное культивирование астроцитов с 3 мкг/мл Shh не привело к достоверномуизменению времени начала гибели клеток по сравнению с контрольными образцами (60,18±0,72и 58,97±1,66 час, соответственно) (рис. 19 г, 20 б).Рисунок 20.
Время начала гибели клеток: U-251 MG с цисплатином 12,5 мкМ (а),астроциты с цисплатином 50 мкМ (б), U-251 MG с темозоломидом 5 мМ (в), астроциты стемозоломидом 5 мМ (г), U-251 MG с доксорубицином 8 мкМ (д), астроциты сдоксорубицином 1 мкМ (е). Стрелками указано время внесения препарата. Значенияпредставлены в виде среднего с планками погрешностей, отображающими стандартноеотклонение.
Звездочкой отмечены не отличающиеся друг от друга выборки.71Изучение цитотоксического действия темозоломида на клетки после ихпредварительного культивирования с циклопамином и лигандом ShhПри внесении (на 50-ый час) 5 мМ темозоломида к клеткам линии U-251 MG, растущимна среде с 5 и 10 мкМ циклопамина, гибель клеток начиналась через 78,04±0,58 и 77,29±1,66часа после начала культивирования, соответственно, что достоверно не отличается. Гибельклеток в контроле начиналась через 83,63±1,53 часа от начала эксперимента, что достоверноотличается от времени начала гибели клеток, предварительно культивированных сциклопамином (рис.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
