Диссертация (1174193), страница 11
Текст из файла (страница 11)
A260/A280 при качественной очисткедолжен находиться в пределах от 1,9 до 2,1 единиц, а A260/A280 в пределах от 2,0 до 2,2единиц. Также на спектрофотометре определяли концентрацию РНК [253].Далее 1500 нг РНК, предварительно смешанной в соотношении 5:1 с буфером внесения(10 мМ Трис-НСl (рН7,6), 0,03% бромфеноловый синий, 60% глицерин, 60 мМ ЭДТА), вносилив кювету с агарозным гелем, помещенную в электрофорезную камеру, содержащуюнеобходимое количество 1х TBE буфера с бромистым этидием 0,5 мкг/мл. Агарозный гельтакже готовили на данном буфере (1 г агарозы добавляли к 100 мл 1х TBE буфера с бромистымэтидием 0,5 мкг/мл). Электрофорез проводили в течение 30 минут при градиентенапряженности 3 В. После этого качество РНК оценивали на цифровой документирующейстанции ImageQuant LAS4000 (GE, Великобритания).
Качество выделенной РНК оценивали посоотношению интенсивностей флуоресценции полос от 28S и 18S рибосомальной РНК.Соотношение интенсивностей флуоресценции должно находиться в пределах от 1,5 до 2,5единиц, в этом случае РНК является нераспавшейся [253].46Перед синтезом кДНК образцы выделенной РНК доставали из кельвинатора, помещали налед и ставили в холодильник на 4˚С для постепенного оттаивания. Данная процедурапроводиласьдлязамороженныхобразцов.Частьобразцовсразупослевыделенияобрабатывались дезоксирибонуклеазой I, после чего проводили синтез кДНК [253].Брали 1000 нг РНК, доводили объем до 8 мкл, добавляли 1 мкл 10х буфера (100 мМ TrisHCl (pH 7,5) 25 мМ MgCl2, 1мМ CaCl2) и 1 мкл раствора дезоксирибонулеазы I (DNase I, RNasefree, 1 ед/мкл (Fermentas, Литва)). Смесь помещали в амплификатор GeneAmp System 9700(Applied Biosystems, США) на 30 минут при температуре 37 ˚С.
Для инактивации ферментадезоксирибонуклеазы I вносили 1 мкл 50 мМ ЭДТА и смесь нагревали до температуры 65 ˚С втечение 10 минут [253].Для синтеза кДНК применяли набор MMLV RT kit (Евроген, Россия). Первоначально длярасплавления вторичных структур РНК смесь нагревали в амплификаторе до 70 ˚С и охлаждалина льду. Для приготовления смеси к 10 мкл раствора суммарной РНК, обработаннойдезоксирибонуклеазойI,добавляли2мклраствораdNTP(по10мМкаждогонуклеозидтрифосфата), 2 мкл DTT (20 мМ), 1 мкл случайных декануклеотидных (20 мкМ) и 1мкл олиго(dT) праймеров (20 мкМ), 4 мкл 5х буфера для синтеза первой цепи (280 мМ Tris-HCl(pH8,7), 375 мМ КСl, 30 мМ MgCl2). В последнюю очередь вносили 1 мкл обратнойтранскриптазы вируса лейкемии мышей (MMLV RT). Готовую смесь помещали вамплификатор, где проводили инкубацию при температуре 37 ˚С в течение 60 минут, а затемпри температуре 70 ˚С в течение 20 минут.
Приготовленные образцы разводили в 100 мклсвободной от ферментов деионизированной воде и хранили при температуре -25 ˚С [253].Полимеразную цепную реакцию в реальном времени проводили для кДНК клеток линийU-87 MG, U-251 MG, культуры астроцитов человека, 25-и первичных образцов глиом 3-ей и 4ой степени злокачественности и 4-х контрольных образцов здоровой ткани мозга послеаутопсии.
Последние 29 образцов были любезно предоставлены Ф.А. Кошкиным из коллекциилаборатории отдела медицинских нанобиотехнологий МБФ РНИМУ им. Н.И. Пирогова.Образцы опухолей были получены в НИИ нейрохирургии им. академика Н.Н. Бурденко в 20122014 годах. Все пациенты подписали информированное согласие. Коллекция состоит изобразцов первичных опухолей, не подвергавшихся химио- и радиотерапии, и контрольныхобразцов.
Гистологический диагноз (в том числе и степень злокачественности) устанавливалсяв НИИ нейрохирургии им. академика Н.Н. Бурденко. Образцы были анонимизированы,гистологический диагноз выдавался пронумерованным в соответствии с номером пробирки. Вкачестве контрольных образцов использовали образцы аутопсии мозга, которые забирали в47течение 7-10 часов после наступления смерти.
Пациенты не страдали онкологическими инеонкологическими заболевания центральной нервной системы [253].После получения, образцы измельчали и помещали в полипропиленовые 15 мл пробирки(Corning, США) и добавляли 3 мл буфера RNAlater RNA stabilization reagent (Qiagen, Германия).Образцы хранились в холодильнике при температуре +4 ˚С от 1 до 7 дней, после чего буферзабирали, а образцы помещали в криопробирки 1,2 мл (Corning, США) и хранили притемпературе от -70 до -80 ˚С [253].Из данных образцов Ф.А. Кошкиным была выделена суммарная РНК и получена кДНК пометодикам, аналогичным применявшимся в нашей работе. Для выделения суммарной РНКткани измельчали в лабораторном гомогенизаторе TissueLyser LT (Qiagen, Германия) cдобавлением 700 мкл QIAzol Lysis Reagent (Qiagen, Германия) [253].2.5 Проведение полимеразной цепной реакции в реальном времениНуклеотидные последовательности исследуемых мРНК брали с ресурса NCBI Gene(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/gene/).
Праймеры подбирали при помощи программы BeaconDesigner 8 (Premier Biosoft International, США). В качестве гена “домашнего хозяйства” былвыбранGAPDH(GAPDH-FAGTAGAGGCAGGGATGATGTT).TTGGTATCGTGGAAGGACTCAОценивалиэкспрессиюмРНКиGAPDH-RGLI1(GLI1-FGCCACCAAGCTAACCTCATGTC и GLI1-R CTGCACTCCGGGGAGAAGAAAAG) и tGLI1(tGLI1-F TGGGGACAGAAGTCAAGTTG и tGLI1-R AATGGAGAGATGACCGTAGGA).Праймеры для GLI1 были подобраны таким образом, чтобы они отжигались на участок,отсутствующий у tGLI1 (рис.
4). Задача по подбору праймеров к tGLI1 оказалась сложнее.Праймеры подбирали так, чтобы они не отжигались на GLI1. Для этого было необходимо,чтобы один из праймеров отжигался на участке соединения второго и четвертого экзонов (рис.4). Испытывали праймеры на клетках глиобластомы человека U-87 MG. Первые 4 пары сдополнительными комбинациями праймеров между собой оказались нерабочими, так как невизуализировался однородный пик на кривой плавления и не было одной полосы наэлектрофорезе.
Успешно отжигалась только пятая пара подобранных праймеров (5’TGGGGACAGAAGTCAAGTTG-3’ и 5’-AATGGAGAGATGACCGTAGGA-3’). Специфическийпродукт на электрофорезе визуализировался только при температуре отжига праймеров от 62 C˚и выше (рис. 5) .48Рисунок 4. Схематическое изображение структуры мРНК GLI1 и сплайсинговоговарианта tGLI1.
Стрелками обозначены прямой и обратный праймеры.Рисунок 5. Электрофорез в агарозном геле, выполненный для продуктов кДНК tGLI1из клеток U-87 MG. Длина продукта (L) равна 167 п.н. Крайняя правая полоса –коммерческий ДНК маркер (Сиб-энзим, Россия).Полимеразную цепную реакцию в реальном времени выполняли на приборе StepOnePlus(Applied Biosystems, США) c использованием готовой смеси qPCRmix-HS SYBR+ROX(Евроген, Россия), содержащей интеркалирующий краситель SYBR Green I.
Для приготовленияреакционной смеси брали 5 мкл деионизированной воды, 2 мкл готовой смеси qPCRmix-HSSYBR+ROX, по 1 мкл обоих праймеров и 1 мкл кДНК [253].Амплификатор настраивали следующим образом: денатурация 5 минут при температуре95˚С, после этого выполнялось 40 циклов (денатурация 20 секунд при 95 ˚С и отжиг 30 секундпри 63˚С). В каждом эксперименте реакции выполняли в 3-х повторах. Каждый экспериментвыполняли 2 раза [253].Для оценки специфичности реакции строили кривые плавления для получаемыхпродуктов полимеразной цепной реакции и проводили электрофорез продуктов в 1% агарозном49геле с последующей детекцией на цифровой документирующей станции ImageQuant LAS4000(GE, Великобритания).
Относительный уровень экспресии рассчитывали при помощи ΔΔСtметода в программе Microsoft Excel 2010. Сt – пороговый цикл реакции. ΔΔСt = (Сtопыте– Сtген “домашнего хозяйства” в опыте) – (Сtген интереса в контроле– Сtген интереса вген “домашнего хозяйства” в контроле)[253,254].2.6 Анализ пролиферации и жизнеспособности клеток с использованием технологииизмерения электрического импедансаРаботапоизучениюпролиферацииклетокиихгибелиподдействиемхимиотерапевтических препаратов выполнялась на приборе xCELLigence (Roche Diagnostics,Швейцария). Клетки культивировали в 16-луночных Е-плашках, помещенных в прибор, на днекоторых расположены золотые микроэлектроды. С помощью электродов прибор автоматическиизмеряет электрическое сопрoтивление клеточной популяции в каждой лунке через заданныепромежутки времени, представляя информацию в реальном времени.
Это позволяетконтролировать жизнеспособность культивируемых клеток.О клеточном статусе можно судить по клеточному индексу – количественномупоказателю, который рассчитывается по формуле:,гдеRcell(ƒ)иR0(ƒ)являютсячастотно-зависимымисопротивлениямизолотыхмикроэлектродов с клетками и без клеток соответственно [255].
Таким образом, чем большеклеток расположено на золотом микроэлектроде, тем больше значение Rcell(ƒ), тем большимоказывается значение КИ, что наблюдается при пролиферации клеток. При гибели клеток,например при старении культуры или при воздействии различных цитотоксических агентовнаблюдается обратный эффект и отмечается уменьшение КИ.На одной Е-плашке размещено 16 лунок. Прибор может измерять сопротивление с трех Еплашек, то есть с 48 лунок.
Плашки могут анализироваться как отдельно, в случае 3-хнезависимых экспериментов, так и вместе, если объединены в рамках одного эксперимента.При необходимости использования более 16 лунок брали вторую Е-плашку.Для того, чтобы к началу эксперимента температура прибора составляла 37˚С егопомещали в инкубатор. В каждую лунку E-плашки вносили по 100 мкл ростовой среды.Плашку ставили в прибор, а через 10 минут измерялось сопротивление R0(ƒ). Это время50необходимо, чтобы температура плашки и среды достигла 37˚С.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
