Диссертация (1174193), страница 13
Текст из файла (страница 13)
Образцы центрифугировали (Eppendorf centrifuge 5810R, Германия) при 400g 7минут при температуре 4°С, отбирали супернатант и добавляли по 300 мкл DMEM+ (4°С).После этого все образцы помещали в холодильник.Начиная с контрольных образцов с ингибитором (образцы с верапамилом), образцыпоочередно инкубировали 5 минут с йодистым пропидием в конечной концентрации 2 мкг/мл(Propidium Iodide Nucleic Acid Stain Solution, Invitrogen, США) и анализировали на клеточномсортере.Флуоресценциюотйодистогопропидия,окрашивающегопогибшиеклетки,регистрировали в двух каналах флуоресценции синего лазера (FL3 с диапазоном длин волн 605635 нм и FL4 с диапазоном длин волн 655-685 нм).
Флуоресценцию от DCV регистрировали вканалах фиолетового лазера (FL6 с диапазоном длин волн 432-482 нм, FL7 с диапазоном длинволн 655-685 нм). Для разделения флуоресценции на каналы между ними был установлендихроичный фильтр (пропускает свет с длинами волн более 506 нм и отражает свет с меньшимидлинами волн).Гейтирование клеток осуществлялось по морфологии и жизнеспособности (выбиралисьнегативные клетки в каналах флуоресценции йодистого пропидия). По контрольным образцам сингибитором устанавливали границу области боковой популяции, после чего в опытныхобразцахопределялипроцентклетокбоковойпопуляции.Визуализацияосуществлялась в программе Summit V5.2.0.7477 (Beckman Coulter, США).данных552.9 Работа с литературойДля поиска литературных источников была использована поисковая система Pubmed базыданных Medline и научная электронная библиотека eLibrary.ru.
Для научных публикаций вавтоматическом режиме или вручную создавалась библиографическая ссылка с информациейпо данной публикации. Управление библиографической информацией осуществлялось спомощью программы EndNote X6 (Thomson Reuters, Канада). Программа использовалась дляцитирования и оформления списка использованной литературы. Кроме того, аппаратныесредства программы позволяли создавать группы из публикаций, прикреплять pdf-версиистатей и делать пометки, что упрощало работу с литературой.2.10 Статистическая обработка полученных результатовСтатистическую обработку полученных результатов проводили при помощи пакетаприкладных программ Statistica 7.0 и Microsoft Excel 2010. Данные представлены в виде M ± σ,где M – среднее или математическое ожидание, σ – стандартное отклонение.В экспериментах по оценке влияния лиганда Shh на пролиферацию клеток использовалипопарное сравнение значений КИ в каждой временной точке с помощью U-критерия МаннаУитни.
Сравнение значений КИ в определенное время проводили c помощью t-критерияСтьюдента. При этом в каждой группе оценивали нормальность распределения значений КИпри помощи критерия Шапиро-Уилка и равенство дисперсий распределения значений КИ припомощи критерия Левена. После этого рассчитывали t-критерий Стьюдента и сравнивали стабличным при α=0,05, а также рассчитывали значение уровня значимости p. При р<0,05принималигипотезу о существованииразличийсреднихзначенийКИ суровнемстатистической значимости p [261, 262].В экспериментах по оценке влияния циклопамина на пролиферацию клеток использовалипопарное сравнение значений КИ в каждой временной точке в образцах, росших с добавлением5 и 10 мкМ циклопамина, и контролем с помощью U-критерия Манна-Уитни. Сравнениезначений КИ в определенное время проводили c помощью метода Краскела-Уоллиса.Определяли значение уровня значимости p, в случае p<0,05 принимали гипотезу, что группыполучены из разных генеральных совокупностей, после чего проводили парное сравнениегрупп.
Дополнительно значения сравнивали при помощи дисперсионного анализа, сначала56проверяли гипотезу о равенстве дисперсий распределения значений КИ при помощи критерияЛевена, после чего проводили дисперсионный анализ. В случае p<0,05 переходили капостериорному сравнению групп. Для анализа связи КИ и концентрации циклопамина(отсутствие циклопамина, 5 и 10 мкМ) использовали оценку корреляции при помощи методаСпирмена. Рассчитывали коэффициент корреляции Спирмена r при уровне значимости p<0,05[261, 262].В экспериментах по оценке цитотоксического действия циклопамина применяли tкритерий Стьюдента в случае двух сравниваемых групп и дисперсионный анализ для трехсравниваемых групп с проведением предварительных оценок гипотез о нормальностираспределений значений и равенстве дисперсий распределения значений, как это описановыше.
Достоверными считали отличия при p<0,05. Для анализа связи процента погибшихклеток и клеток в состоянии апоптоза с концентрацией циклопамина (отсутствие циклопамина,5 и 10 мкМ) использовали оценку корреляции при помощи метода Спирмена при уровнезначимости p<0,05 [261, 262]. Аналогичным образом проводили статистическую обработкуданных в экспериментах по определению процента клеток боковой популяции.В экспериментах по оценке времени начала гибели клеток применяли t-критерийСтьюдента в случае двух сравниваемых групп и дисперсионный анализ для трех сравниваемыхгрупп с проведением предварительных оценок гипотез о нормальности распределений значенийи равенстве дисперсий распределения значений, как это описано выше.
Дополнительноприменяли U-критерий Манна-Уитни и метод Краскела-Уоллиса, дополненный парнымсравнением групп. Достоверными считали отличия при p<0,05. Для анализа связи времениначала гибели клеток с концентрацией циклопамина (отсутствие циклопамина, 5 и 10 мкМ)использовали оценку корреляции при помощи метода Спирмена при уровне значимости p<0,05[261, 262].В экспериментах по оценке уровня экспресии GLI1 применяли U-критерий Манна-Уитнии метод Краскела-Уоллиса, дополненный парным сравнением групп.
Достоверными считалиотличия при p<0,05 [261, 262].57Глава 3. Результаты3.1 Оценка уровня экспрессии GLI1 и tGLI1Экспрессию tGLI1 оценивали в клетках линий U-87 MG, U-251 MG, клетках культурыастроцитов, 25 первичных образцах глиом 3 и 4 степени злокачественности и 4-х образцахздоровой ткани мозга (образцы кДНК были любезно предоставлены Ф.А. Кошкиным).Экспрессия tGLI1 была обнаружена только в культуре глиобластомы человека U-87 MG.Количество tGLI1 в клетках линии U-87 MG значительно меньше, чем GLI1.
Одинаковогоуровня флуоресценции продукты ПЦР для мРНК GLI1 и tGLI1 достигают с разницей в 7,5циклов (рис. 7). По грубым подсчетам, пренебрегая эффективностью ПЦР и длиной образуемыхпродуктов, получается, что количество мРНК tGLI1 примерно в 180 раз меньше (27,5), чем GLI1.В отличие от кривых накопления для мРНК GLI1, кривые накопления для мРНК tGLI1 несовпадают друг с другом, следовательно при сравнении данные по количеству мРНК tGLI1будут иметь большую стандартную ошибку среднего арифметического и большое стандартноеотклонение.Рисунок 7.
Графики накопления продуктов полимеразной цепной реакции для GLI1и tGLI1.Экспрессию GLI1 оценивали в клеточных линиях и первичных образцах глиом. Вкультуре клеток U-87 MG было обнаружено повышение уровня мРНК GLI1 в 7,5 раз по58сравнению с клетками астроцитов человека, что достоверно отличается (рис. 8 а). В клеткахлинии U-251 MG уровень экспрессии GLI1 был в 4,7 раза выше, чем в астроцитах, чтодостоверно отличается (рис.
8 а). При исследовании первичных образцов глиом былообнаружено, что уровень экспрессии GLI1 достоверно не превышает таковой уровень вконтрольных образцах здоровой ткани мозга (рис. 8 б).Рисунок 8. Диаграммы, отображающие уровень экспрессии GLI1 в клетках линий U251 MG и U-87 MG относительно культуры астроцитов (а) и в образцах глиом 3 и 4степени злокачественности относительно образцов здоровой ткани мозга (б).3.2 Изучение влияния сигнального пути Hedgehog на пролиферацию клетокОпределение оптимального количества клеток в титрационном тестеКультуры клеток отличаются скоростью роста, поэтому в первую очередь нами былвыполнен тест, где оценивалась зависимость пролиферации от количества посаженных клетокдля каждой исследуемой культуры.
Отталкиваясь от рекомендаций производителя (RocheDiagnostics), мы пришли к выводу, что оптимальным является такое количество клеток призасеве культуры, при котором значение КИ через 10 часов культивирования будет находится впределах от 0,5 до 1,0 усл. ед.. Таким образом, количество посаженных клеток на лункусоответствовало 5000 для культуры астроцитов человека (рис.
9), 20000 – для линии глиомы U87 MG, 10000 – для линии глиомы U-251 MG (данные не представлены).59Рисунок9.ЗависимостьКИкультурыастроцитовчеловекаотвременикультивирования и количества посаженных клеток. Планки погрешностей отображаютстандартное отклонение.Изучение эффекта лиганда Shh на пролиферацию клетокПосле определения оптимального количества засева клеток мы изучили влияние лигандаSHH и циклопамина на процессы клеточной пролиферации исследуемых культур. ДобавлениеShh в конечной концентрации 3 мкг/мл к клеткам линии глиобластомы U-251 MG приводило кувеличению пролиферации клеток (рис. 10).Рисунок 10. Зависимость КИ от времени культивирования с Shh для клеток линииглиомы U-251 MG. Планки погрешностей отображают стандартное отклонение.60Попарное сравнение значений КИ с помощью U-критерия Манна-Уитни показалодостоверное различие между образцами с добавлением и без добавления лиганда (контроль сдобавлением ростовой среды вместо лиганда).
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
