Диссертация (1174193), страница 17
Текст из файла (страница 17)
Именно к этому участкумы подбирали один из праймеров.77Методом ПЦР-РВ нами было обнаружено, что tGLI1 определяется только в клетках линииглиобластомы U-87 MG и не обнаруживается ни в клетках линии U-251 MG, ни в клеткахкультуры астроцитов человека, ни в первичных образцах глиом и здоровой ткани мозга (25первичных образцов глиом 3-ей и 4-ой степени злокачественности и 4 образца здоровой тканимозга). В литературе отмечается, что tGLI1 встречается в некоторых клеточных линияхглиобластомы (U-87 MG и U-251 MG не анализировались) и в первичных образцах(представлены данные только по трем образцам), но не встречается в здоровых тканях мозга идругих органов. Также отмечается, что экспрессия tGLI1 наблюдается в первичных образцахрака молочной железы [56]. Несмотря на то, что наши данные расходятся с даннымилитературы, мы не считаем, что они противоречат друг другу.
Во-первых, рассмотреннаяработа была выполнена только одним коллективом авторов при помощи аналитического методаПЦР с последующим гель электрофорезом. Во-вторых, зачастую авторы не сходятся во мнениипо экспрессии генов НН сигналинга. Так отмечается неоднозначность результатов экспресииболее изученного GLI1 при глиомах 3-ей и 4-ой степени злокачественности [36, 58, 93, 94].Нами было показано, что по грубым подсчетам количество мРНК tGLI1 в клетках линииU-87 MG примерно в 180 раз меньше, чем количество мРНК GLI1. Кроме того, кривыенакопления для мРНК tGLI1 не совпадают друг с другом, вследствие чего данные поколичеству мРНК tGLI1 имеют большую стандартную ошибку среднего арифметического ибольшое стандартное отклонение. Таким образом, методика количественной ПЦР-РВ непозволит получать достоверные данные по экспрессии tGLI1 и в последующем оцениватькорреляциюмеждуэкспрессиейtGLI1игенами,ассоциированнымиспроцессамипролиферации и химиорезистентности.
Для такой задачи больше подойдет либо методикацифровой ПЦР, либо трансфекция tGLI1 и GLI1 в клетки разных культур с последующейоценкой экспрессии генов интереса. Стоит отметить, что низкая экспрессия tGLI1 не снижаетвозможного влияния данной изоформы транскрипционного фактора на процессы пролиферациии химиорезистентности. Кроме того, отсутствие tGLI1 в культуре U-251 MG и впроанализированных первичных образцах глиом 3-ей и 4-ой степени злокачественности неотрицает тот факт, что данная изоформа может быть выявлена методом цифровой ПЦР илиможет быть гиперэкспрессированна в других образцах, например, полученных после удалениярецидивирующих опухолей, как это наблюдалось в некоторых работах на примерегиперэкспрессии GLI1 [95].При оценке экспрессии GLI1 в клеточных линиях, было показано, что по сравнению скультурой клеток астроцитов, в клетках линии глиомы U-87 MG экспрессия GLI1 повышена в787,5 раз, а в клетках линии U-251 MG – в 4,7 раз, что соответствует литературным данным сповышенным уровнем экспресии GLI1 в опухолевых клеточных линиях [36, 58, 93].При исследовании 25 образцов глиомы 3-ей и 4-ой степени злокачественности былообнаружено, что уровень экспрессии GLI1 не превышает таковой уровень в контрольныхобразцах здоровой ткани мозга (4 образца).
Анализ научной литературы демонстрируетнеоднозначность имеющихся данных, касающихся экспрессии GLI1 в первичных образцахглиом. Кроме того, отчетливо прослеживается идея некоторых авторов, в соответствии скоторой по наличию или отсутствию экспрессии GLI1 делаются выводы об активностисигнального пути HH в клеточных культурах или первичных образцах [36, 93-95].С одной стороны, авторы отмечают гиперэкспрессию GLI1 при глиомах 3-ей и 4-ойстепеней злокачественности (не во всех первичных образцах) [93]. С другой стороны, естьданные, что экспрессия GLI1 в глиобластомах не превышает уровня в контрольных образцах,полученных из височной доли пациентов с эпилепсией, в то время как гиперэкспрессия GLI1отмечается при глиомах 2-ой и 3-ей степеней злокачественности [94].
Вместе с тем, влитературе неоднократно отмечается повышение уровня экспрессии GLI1 в большинствеклеточных линий глиобластом и низкий уровень экспрессии GLI1, сопоставимый сконтрольным в клеточных линиях, полученных из первичных образцов опухолей [36, 58, 94].Аналогичные результаты по уровню экспресии GLI1 были получены и в нашем исследовании.По некоторым данным, активация (повышение экспрессии GLI1) сигнального пути ННпроисходит при рецидивирующих глиобластомах, возникающих после курсов химиотерапии[94, 95].Однако, по данным, полученным при помощи ПЦР-РВ, не верно делать предположение обактивности сигнального пути HH, так как не всегда высокий уровень экспрессии GLI1 связан сповышенной активностью сигнального пути, а низкий уровень GLI1 с его низкой активностью.Причина данного несоответствия может заключаться в ингибировании синтеза GLI1 на уровнетрансляции, что требует дополнительного изучения [97].
Таким образом, исследованиеэкспрессии GLI1, как основного показателя активности сигнального пути HH не совсем верно.Одними авторами в качестве оптимального метода оценки активности транскрипционногофактора GLI1 в культурах клеток предлагается использовать репортерный ген люциферазы [97,98]. Другие авторы предлагают иммунофлуоресцентные методы [91]. Таким образом передисследователями встает актуальная проблема оценки активности сигнального пути приглиомах, потому что в настоящее время нет однозначной стратегии.79Некоторые авторы не стараются оценивать непосредственно активность сигнального пути,а просто выясняют его влияние на процессы ангиогенеза, пролиферации, химиорезистентностии процессы стволовости [59, 151, 203, 206].
При таких экспериментальных подходах по этимпараметрам можно судить об активности пути, не останавливаясь на различных механизмахингибирования, действующих после синтеза мРНК, что нами и было сделано.Получив данные о том, что уровень GLI1 в первичных послеоперационных образцах неотличается от контрольных, и приняв во внимание тот факт, что не всегда уровень экспрессииGLI1 связан с активностью сигнального пути из-за возможных механизмов ингибирования, мыпришли к выводу, что оценивать экспрессию GLI1 и генов, ассоциированных с пролиферациейи химиорезистентностью с изучением их корреляции будет недостоверно. Поэтому мы перешлик следующей части нашей работы, основанной на изучении непосредственного влияниясигнального пути на процессы пролиферации и химиорезистентности.Для оценки влияния сигнального пути на процессы пролиферации, мы решиливоздействовать на сигнальный путь НН посредством его стимуляции и ингибирования.
Последанных воздействий мы анализировали как изменилась клеточная пролиферация.В качестве активатора был взят рекомбинантный человеческий N-концевой полипептидShh (PeproTech). Этот способ повышения активности сигнального пути является прямым,наиболее простым и используемым [59, 102].
Прямым он является в силу того, что лиганд Shh –главный активатор НН сигналинга в клетках человека. Другими потенциальными способамиповысить активность сигнального пути является ингибирование супрессоров НН сигналинга, ккоторым относятся HHIP, PTCH1 и SUFU. Это само по себе является целой работой,направленной на изучение роли данных факторов в функционировании НН сигнального пути втех или иных клеточных линиях, где необходим подбор ингибиторов, их концентраций иопределение количества как мРНК, так и самих интересующих нас белков.
Особенно интереснобыло бы оценить роль неоднозначно влияющего на сигнальный путь НН фактора SUFU. Неразобравшись в этих аспектах, использовать данный подход для повышения активностисигнального пути было бы не правильно.Согласно данным мировой литературы, циклопамин и GANT-61 являются наиболее частоиспользуемыми ингибиторами сигнального пути.
Выбор циклопамина в нашей работе былобусловлен тем, что этот препарат оказывает ингибирующее влияние непосредственно наклассический сигнальный путь НН. Это и оказалось необходимым в нашей работе. В то времякак GANT-61 ингибирует транскрипционный фактор GLI1, то есть ингибирует какклассический, так и неканонический сигналинг, обусловленный влиянием других молекул и80сигнальных путей на HH сигналинг. В большинстве исследований, посвященных глиомам,также применялся циклопамин [92, 93].В качестве растворителя циклопамина допускается использовать этанол (2% раствор),метанол (0,7% раствор) и DMSO (0,4% раствор).
Несмотря на более высокую растворимость вэтаноле и метаноле, производители рекомендуют растворять циклопамин в DMSO. Прирастворении в метаноле и этаноле возможно постепенное увеличение концентрации препаратаза счет испарения растворителя. 0,4% циклопамин соответствует концентрации раствора 9,72мМ. Для удобства была взята концентрация 5 мМ. Как показали первые эксперименты,внесение DMSO приводило к достоверному дозозависимому увеличению клеточнойпролиферации по сравнению с клетками без DMSO. При растворении циклопамина в этанолеудалось добиться концентрации 40 мМ, что позволило снизить концентрацию растворителя(этанола по сравнению с DMSO) в 8 раз.
Однако, в экспериментах (данные не представлены)также наблюдалось достоверное дозозависимое увеличение клеточной пролиферации. Такоевлияние растворителей может быть обусловлено изменением свойств мембраны клеток, врезультате чего в клетки поступает больше питательных веществ. Учитывая данныенаблюдения и рекомендации производителя циклопамина, в качестве растворителя мыприменяли DMSO.Мы выяснили, что при внесении циклопамина наблюдается дозозависимое снижениепролиферации клеточных линий глиобластомы U-251 MG и U-87 MG, но не наблюдалосьуменьшение пролиферации в культуре астроцитов человека.
Эти данные демонстрируют, чтоциклопамин, посредством ингибирования сигнально пути НН, уменьшает пролиферациюклеток глиомы, где сигнальный путь активен. Это обусловлено тем, что при ингибированииSMO снижается экспрессия гена транскрипционного фактора GLI1, что прямым образомсказывается на транскрипции целевых генов [91, 93].
Отсутствие эффекта циклопамина накультуру астроцитов человека свидетельствует в пользу того, что в нормальных астроцитах ННсигналинг не активен и не влияет на процессы клеточной пролиферации.Похожие результаты отмечаются в некоторых других исследованиях. Но в качествеконтроля использовалась не культура астроцитов, а линия глиомы A172, в которой экспрессияGLI1 значительно ниже, чем в линиях U-87 MG и U-251 MG [91].
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
