Диссертация (1174193), страница 18
Текст из файла (страница 18)
Так при внесениициклопамина (5 и 10 мкМ) к клеточным линиям U-87 MG, U-251 MG и SHG44 отмечалосьснижение клеточной пролиферации, однако данный эффект не отмечался для линии глиомыА172. Эти данные были получены при помощи колориметрического метода с использованиемреагента XTT [91].81Так как циклопамин в концентрации 5 и 10 мкМ не снижает рост клеток культурыастроцитов, то справедливо отметить, что циклопамин в данных концентрациях не оказываетцитотоксическийпролиферациюэффектклеток(прямойкультурыиННсигналинг-опосредованный)астроцитовчеловека.иСледовательно,неснижаетсправедливоутверждение, что циклопамин в данных концентрациях не оказывает прямого цитотоксическогодействия на линии U-87 MG и U-251 MG.
А наблюдаемое снижение клеточного роста этихкультур может быть обусловлено как действием циклопамина на пролиферацию, так и на HHсигналинг-опосредованную гибель клеток. К сожалению, при помощи технологии измеренияэлектрического импеданса в реальном времени или колориметрических методов, выяснитьотдельный вклад пролиферации и гибели клеток в уменьшение клеточного роста невозможно.Для выяснения вклада НН сигналинг-опосредованной гибели клеток в снижение ростаклеток мы провели тест на определение количества погибших клеток и клеток в состоянииапоптоза. Для того, чтобы наши данные можно было сопоставить с данными, полученными вэкспериментах по измерению электрического импеданса, мы выращивали клетки вмаксимально похожих условиях, то есть брали одинаковое количество клеток на единицуплощади и кроме одинаковой концентрации циклопамина брали и нормированное количествоциклопамина на число клеток.В первую очередь мы провели данный тест на клетках культуры астроцитов человека.Здесь стоит вернуться к экспериментам по изучению роста клеток и отметить, что добавление20 мкМ циклопамина, в отличие от 5 и 10 мкМ, снижало рост клеток (рис.
16). Но выяснитьпричины данного снижения при помощи метода измерения электрического импеданса непредставлялось возможным. При оценке жизнеспособности клеток мы обнаружили, чтоколичество погибших клеток и клеток в состоянии апоптоза при концентрации циклопамина 5 и10 мкМ и культивировании в течение 50 часов не отличалось от контроля с 0,2% DMSO.Однако при добавлении к клеткам 20 мкМ циклопамина в световой микроскоп было видно, чтопримерно на 30-40% площади поверхности лунок клетки оставались прикрепленными кпластику (визуально сравнивалось с контролем с 0,4% DMSO). Среди клеток, снятых спластика, увеличилось количество погибших и апоптотических клеток.
Эти данныеподтверждают данные литературы о том, что в концентрации более 10 мкМ циклопаминоказывает цитотоксический эффект на клетки вне зависимости от функционирования ННсигналинга [91].Необходимо отметить, что в нашу задачу не входило определение концентраций, прикоторых начинается прямое цитотоксической действие препарата.
Мы показали, что в рабочих82концентрациях 5 и 10 мкМ прямого цитотоксического действия циклопамина на клетки ненаблюдается.В экспериментах с добавлением 5 и 10 мкМ циклопамина к клеткам глиом линийU-251 MG и U-87 MG наблюдалось дозозависимое увеличение процента погибших иапоптотических клеток, то есть наблюдалось цитотоксическое действие циклопамина на клеткиглиом. Учитывая тот факт, что циклопамин в концентрации 5 и 10 мкМ не оказывалцитотоксического действия на клетки астроцитов, мы предполагаем, что механизмцитотоксического действия циклопамина на клетки глиом являетсяНН сигналинг-опосредованным.
Аналогичные рассуждения встречаются и в литературе, где вместоастроцитов используется линия глиомы A172 [91].Возвращаясь к оценке КИ линий глиом U-251 MG и U-87 MG, справедливо возникаетвопрос, связано ли снижение КИ с уменьшением пролиферации, или это наблюдается в связи сцитотоксическим действием циклопамина на клетки. Для того, чтобы разобраться в этомвопросе, вернемся к количественным показателям изменения КИ при внесении циклопамина.Клеточный индекс зависит от количества жизнеспособных клеток, прикрепленных ко днулунки. Эти данные мы сравниваем с изменением количества жизнеспособных клеток вэкспериментах по оценке жизнеспособности клеток.
При этом клетки в состоянии апоптоза мытоже будем учитывать, так как в экспериментах с измерением электрического импеданса клеткив состоянии апоптоза еще прикреплены ко дну лунок и вносят вклад в общее сопротивление.Для клеток линии U-251 MG через 50 часов инкубации клеток с циклопамином КИ уменьшилсяв 1,32 (5 мкМ) и 1,88 (10 мкМ) раз по сравнению с контролем. Количество жизнеспособныхклеток в экспериментах по оценке жизнеспособности клеток уменьшилось в 1,05 и 1,06 раз дляклеток с добавлением 5 мкМ и 10 мкМ циклопамина, соответственно.Для клеток линии U-87 MG через 60 часов инкубации с циклопамином КИ уменьшился в1,16 (5 мкМ) и 1,65 (10 мкМ) раз по сравнению с контролем. Количество жизнеспособныхклеток в экспериментах по оценке жизнеспособности клеток уменьшилось в 1,04 и 1,06 раз дляклеток с добавлением 5 мкМ и 10 мкМ циклопамина, соответственно.Таким образом, видно, что снижение КИ в клеточных линиях глиом обусловлено вбольшей степени уменьшением клеточной пролиферации и в меньшей степени НН сигналингопосредованным цитотоксическим действием циклопамина.ДополнительнуюинформациюовлияниисигнальногопутиННнапроцессыпролиферации мы получили из экспериментов с добавлением лиганда Shh.
Так при добавлении83лиганда в концентрации 3 мкг/мл отмечается увеличение пролиферации клеток линии U251 MG и культуры астроцитов. Однако, данный эффект не наблюдался для клеток линии U87 MG.С одной стороны, полученные данные не соответствуют ожидаемым данным, по аналогиис циклопамином, что отсутствие эффекта будет отмечаться для астроцитов. С другой стороны,интерпретация этих данных позволяет сделать предположения об активности сигнального пути.Так, в нашей работе при внесении циклопамина и лиганда Shh отмечается три вариантаповедения клеток.Пролиферация клеток U-251 MG снижалась при добавлении циклопамина, в то время каквнесение Shh приводило к ее увеличению.
Справедливо предположить, что НН сигнальныйпуть находится в активном состоянии, но так как внесение Shh ведет к дополнительномуувеличению пролиферативной способности клеток, то НН сигнальный путь в этих клеткахнаходитсявнеполностьюактивномсостоянии.Добавлениециклопаминаснижаетпролиферацию клеток глиомы U-87 MG, но внесение Shh не оказывает дополнительногоэффекта. Мы предположили, что НН сигнальный путь в клетках U-87 MG функционируетмаксимально активно. Циклопамин не влияет на пролиферацию клеток культуры астроцитовчеловека, но лиганд Shh оказывает стимулирующее влияние на процессы пролиферации. Такимобразом, можно предположить, что в астроцитах сигнальный путь не активен, но находится вмолчащем состоянии, когда при внешнем воздействии сигналинг может стать активным.
Этиданные наводят на мысли о влиянии паракринной регуляции на запуск процессов онкогенеза вздоровых клетках. Так, в литературе отмечается, что кокультивирование клеток глиобластомы иэндотелиоцитов приводит к обоюдному увеличению активности сигнального пути [105, 106].Наша следующая задача состояла в оценке влияния НН сигнального пути нарезистентность (чувствительность) исследуемых культур к химиотерапевтическим препаратам.Мы выбрали цисплатин, темозоломид и доксорубицин.
Темозоломид был выбран изсоображений, что данное вещество в настоящее время применяется в комплексной терапииглиом 3-ей и 4-ой степеней злокачественности [20]. Цисплатин и доксорубицин были выбраны,так как относятся к разным классам химиопрепаратов, для которых отличаются механизмыхимиорезистентности.Мы решили отказаться от использования колориметрических тестов, так как послепредварительного внесения активатора или ингибитора сигнального пути изменяетсяпролиферативная активность клеток, вследствие чего на момент внесения химиопрепарата вразных лунках будет разное количество клеток, что затрудняет интерпретацию данных84колориметрических тестов.
По аналогичным соображениям оценивать изменения КИ послевнесения химиопрепарата также не совсем верно.Для оценки влияния НН сигналинга на химиочувствительность клеток глиом мыразработали собственную методику. Суть методики заключается в том, что послекультивирования клеток в течение 2-х суток с циклопамином или лигандом Shh мы вносилихимиотерапевтические препараты в заранее выбранных концентрациях и определяли время,через которое клетки начинали погибать. Необходимо отметить, что химиотерапевтическиепрепараты мы вносили вместе со свежей средой, предварительно отобрав среду сциклопамином, Shh и DMSO.Возвращаясь к методике измерения электрического импеданса, необходимо отметить, чтоприбор измеряет электрическое сопротивление, которое зависит от количества жизнеспособныхклеток, прикрепленных ко дну лунки, и площади их контакта, и выдает нам результат в видезначения КИ. Прибор не может оценивать сколько клеток погибает, а сколько новых клетоквырастает в выбранный промежуток времени.
Вместо этого прибор оценивает совокупностьданных процессов.Пока клетки растут без химиопрепарата, процессы пролиферации преобладают надпроцессами естественной гибели клеток. Мы наблюдаем дальнейший рост кривой зависимостиКИ от времени. После внесения химиопрепарата начинают погибать первые клетки, возможно,дополнительно снижается пролиферативная активность клеток. Некоторое время процессыпролиферации еще преобладают над процессами гибели клеток. В это время на кривой мынаблюдаем снижение, то есть снижение скорости изменения КИ по времени. Но.В какой-то момент времени процессы пролиферации сравниваются с процессами гибеликлеток.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
