Диссертация (1174193), страница 16
Текст из файла (страница 16)
20 в). Коэффициент корреляции Спирмена r для времени начала гибеликлеток = -0,78. В образцах с 10 мкМ циклопамина гибель клеток начиналась через 27,29 часовпосле внесения темозоломида, что в 1,23 раза меньше чем в контрольных образцах (33,63 часа).Гибель клеток, предварительно культивированных с 3 мкг/мл Shh начиналась через 85,38±0,73часов, что достоверно не отличается от контроля (85,05±1,13 час от начала эксперимента) (рис.20 в).При внесении (на 50-ый час) 5 мМ темозоломида к клеткам культуры астроцитов,растущим на среде с 5 и 10 мкМ циклопамина, гибель клеток начиналась через 54,76±0,75 и55,01±0,43 часа после начала культивирования, соответственно, что достоверно не отличается.Гибель клеток в контроле (0,2% DMSO) начиналась через 54,51±0,43 час, что достоверно неотличается от данных, полученных для клеток, предварительно культивированных сингибитором сигнального пути (рис.
20 г). Предварительное культивирование астроцитов с 3мкг/мл Shh не привело к достоверному изменению времени начала гибели клеток по сравнениюс контрольными образцами (61,95±0,72 и 62,76±0,43 час, соответственно) (рис. 20 г).Изучение цитотоксического действия доксорубицина на клетки после ихпредварительного культивирования с циклопамином и лигандом ShhВнесение 8 мкМ доксорубицина (на 47-ой час) к клеткам линии U-251 MG, растущим вприсутствии 5 и 10 мкМ циклопамина, приводило к тому, что гибель клеток начиналась на57,50±0,43 и 55,25±0,43 час после начала культивирования, соответственно, что достоверноотличается. Гибель клеток в контроле начиналась через 59,76±0,43 часа от началаэксперимента, что достоверно отличается от времени начала гибели клеток, предварительнокультивированных с циклопамином (рис.
20 д). Коэффициент корреляции Спирмена r длявремени начала гибели клеток = -0,96. В образцах с 10 мкМ циклопамина гибель клетокначиналась через 10,25 часов после внесения темозоломида, что в 1,44 раза меньше чем вконтрольных образцах. Гибель клеток, предварительно культивированных с 3 мкг/мл Shh72начиналась через 55,31±0,72 часов, что достоверно отличается от контроля (52,99±0,42 час)(рис. 20 д).Внесение 1 мкМ доксорубицина (на 45-ый час) к астроцитам, растущим в присутствии 5 и10 мкМ циклопамина, приводило к гибели клеток через 54,14±0,29 и 54,89±1,01 часа посленачала культивирования, соответственно, что достоверно не отличается. Гибель клеток вконтрольных образцах начиналась через 55,06±0,76 часов, что достоверно не отличается отрезультатов, полученных для клеток, предварительно культивированных с циклопамином (рис.20 е).
Предварительное культивирование астроцитов с 3 мкг/мл Shh не привело к достоверномуизменению времени начала гибели клеток по сравнению с контрольными образцами (55,44±0,43и 55,14±1,15 час, соответственно) (рис. 20 е).Таким образом, предварительное культивирование клеток глиомы человека линии U251 MG в присутствии циклопамина приводит к более раннему началу гибели опухолевыхклеток при воздействии выбранных химиотерапевтических препаратов. Напротив, активациясигнального пути при помощи лиганда Shh приводит к уменьшению чувствительности клеток кхимиотерапевтическим препаратам (цисплатин и доксорубицин).
В клетках астроцитовчеловека внесение циклопамина и лиганда Shh не влияло на время начала гибели клеток всравнении с контрольными образцами.Изучение поведения клеток при изменении состава ростовой средыДля анализа влияния DMSO и циклопамина на поведения клеток был проведендополнительный контрольный эксперимент с клетками линии U-251 MG. Первоначальноклетки выращивали двое суток в присутствии 0,2% DMSO (кривая 1) и циклопамина вконцентрации 5 и 10 мкМ (кривая 4) (рис. 21; для удобства восприятия представлена толькокривая для концентрации циклопамина 10 мкМ). После этого часть клеток продолжила расти вприсутствии 0,2% DMSO (кривая 2), а в части лунок среду сменили на свежую (кривая 3).Аналогично часть клеток продолжила расти в присутствии циклопамина (кривая 5), а в частилунок среду сменили (кривая 6).После смены среды c DMSO на свежую среду наблюдалось дальнейшее увеличении КИ,но скорость роста клеток была несколько ниже, чем в контроле, где клетки продолжали растибез смены среды (кривые 3 и 2, соответственно (рис.
21)). Удаление из среды циклопамина вкультурах, растущих первоначально в его присутствии, приводило как к увеличению КИ, так ик увеличению скорости роста клеток при сравнении с контролем, где среду не меняли (кривые 6и 5 (рис. 21)).73Рисунок 21. Изменение клеточного индекса для клеток линии U-251 MG при сменеусловий культивирования. В течение двух суток клетки выращивали в ростовой среде с0,2% DMSO (кривая 1) и 10 мкМ циклопамина (кривая 4), после чего в половине лунокотбирали среду и заменяли свежей ростовой средой (кривые 3 и 6, соответственно).
Востальных лунках смену среды не проводили (кривые 2 и 5, соответственно). Стрелкойуказано время внесения свежей среды. Кривые 2 и 5 являются продолжением кривых 1 и4, соответственно.3.5 Изучение влияния сигнального пути Hedgehog на формирование фенотипаклеток боковой популяцииДляколичественногоопределенияпроцентаклетокбоковойпопуляции(SP)использовался ингибиторный контроль с верапамилом в концентрации 50 мкМ. Верапамилявляется конкурентным ингибитором DCV, вследствие чего молекулы DCV проникают внутрьклетки и не экспортируются ABC транспортерами из клетки. Граница боковой популяциивыставлялась по ингибиторному контролю с верапамилом, а для точности измерений былопринято решение, чтобы в эту область попадало не более 0,05% событий в контроле.Процент клеток боковой популяции для клеточной линии U-87 MG составил 1,51±0,25%(рис. 22).
0,05% событий, которые попадали в аналогичную область в ингибиторном контролене вычитались из процента клеток боковой популяции. Так делают в мировой литературе и покаеще не точно ясна природа этих событий. Это могут быть клетки, не относящиеся к боковойпопуляции, но, в силу статистического распределения, попавшие в этот регион, либо клетки с74каналами, которые менее эффективно или вовсе не ингибируются, но принимают участие втранспорте DCV из клетки.Рисунок 22. Точечные диаграммы, построенные в каналах флуоресценции DCV,позволяющие определить процент боковой популяции в культуре клеток U-87 MG.
Всиний канал попадает флуоресценция с длинами волн 432-482 нм, в красный – 655-685 нм.(а) SP – клетки боковой популяции. (б) - ингибиторный контроль с концентрациейверапамила 50 мкМ. Границей установлен уровень боковой популяции на диаграмме (а).В аналогичную область на диаграмме (б) попадает не более 0,05% клеток. Цветоваяшкала отображает плотность событий.Процент клеток боковой популяции для клеточной линии U-251 MG составил 1,41±0,29%.В культуре астроцитов человека клеток боковой популяции не было обнаружено, поэтомуоценка влияния циклопамина на процент клеток боковой популяции не осуществлялась.Было обнаружено, что культивирование клеток в присутствии 0,2% DMSO приводило кувеличению процента клеток боковой популяции.
Так для линии U-87 MG при тех же условияхпроведения эксперимента процент боковой популяции увеличился до 5,20±0,23% – процентклеток боковой популяции в контроле, (рис. 23 а). Процент боковой популяции для клеток U87 MG, росших в присутствии 5 и 10 мкМ циклопамина, составил 3,84±0,62% и 1,70±0,47%,соответственно.
Три группы достоверно отличаются между собой (рис. 23 б, в). Коэффициенткорреляции Спирмена r для процента клеток боковой популяции = -0,95.Аналогично культивирование клеток линии U-251 MG в присутствии 0,2% DMSOприводило к увеличению процента клеток боковой популяции до 3,69±0,39%. Процент боковойпопуляции для клеток U-251 MG, росших в присутствии 5 и 10 мкМ циклопамина, составил752,15±0,27% и 1,43±0,26%, соответственно, что достоверно не отличается между собой, нодостоверно отличается от контроля.
Коэффициент корреляции Спирмена r для процента клетокбоковой популяции = -0,95. Необходимо напомнить, что ингибиторный контроль сверапамилом выполнялся для каждой серии экспериментов (рис. 23 г).Рисунок 23. Точечные диаграммы, построенные в каналах флуоресценции DCV,позволяющие определить процент боковой популяции в культуре клеток U-87 MG послекультивирования клеток с циклопамином. В синий канал попадает флуоресценция сдлинами волн 432-482 нм, в красный – 655-685 нм.
SP – клетки боковой популяции. (а) –клетки с 0,2% DMSO, (б) – клетки с 5 мкМ циклопамина, (в) – клетки с 10 мкМциклопамина, (г) ингибиторный контроль с концентрацией верапамила 50 мкМ.Цветовая шкала отображает плотность событий.76Глава 4. ОбсуждениеВ последнее время HH сигналинг активно изучается, и наблюдается тенденция кпостоянному росту количества публикуемых работ, согласно данным NCBI Pubmed.
Означимости сигнального пути говорит и тот факт, что в пересмотренном 4-ом изданииклассификации опухолей головного мозга, основанной не только на гистологических, но и намолекулярно-генетических особенностях опухолей, выделяют медуллобластомы с вовлечениеми без вовлечения НН сигнального пути [19]. Показано, что сигнальный путь НН вовлечен впроцессы эмбриогенеза, стволовости и канцерогенеза [7, 14, 24, 27]. Сложность изучениясигнального пути подтверждает тот факт, что только недавно было обнаружено, что один изглавных компонентов сигнального пути – SUFU по неизвестным причинам может выступать нетолько ингибитором сигналинга, но и активатором, увеличивая способность транскрипционныхфакторов семейства GLI связываться с ДНК [35]. Также открыто уже несколько изоформтранскрипционного фактора GLI1, которые присутствуют в разных клетках и роль которых доконца не изучена [15, 55, 56].В 2009 году был обнаружен транскрипционный фактор tGLI1, мРНК которого являетсяпродуктом альтернативного сплайсинга GLI1.
В ферменте отсутствует 41 а.к. Это соответствуетисключению полностью 3-го и частично 4-го экзона в мРНК GLI1 [56]. Есть несколько работ,показывающих, что tGLI1 в большей степени влияет на процессы химиорезистентности,ангиогенеза,пролиферации,чемфактор GLI1[10,14,57,154,169]. Этобылопродемонстрирован только при помощи трансфекции раздельно tGLI1 и GLI1 в клетки споследующим изучением данных процессов.Перед нами стояла задача выяснить, возможно ли оценивать экспрессию двух изоформ вотдельности. Далее в случае положительного результата необходимо было оценить уровень ихэкспрессии.
После этого необходимо было проверить, способны ли мы методом ПЦР-РВоценить влияние двух изоформ на процессы пролиферации и химиорезистентности.Нам впервые удалось подобрать праймеры таким образом, чтобы независимо друг отдруга оценивать экспрессию как GLI1, так и tGLI1. Подбор праймеров к GLI1 не вызвал труда,так как праймеры были подобраны к участку, отсутствующему у сплайсингового вариантаtGLI1. Успешно подобрать праймеры к сплайсинговому варианту tGLI1 было довольно сложно,из-за того, что в tGLI1 единственным уникальным регионом, который отсутствует в GLI1,является место соединения второго экзона и остатка четвертого экзона.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
