Диссертация (1174193), страница 14
Текст из файла (страница 14)
Оценивая количественные изменения, мынаблюдали, что значение КИ через 50 часов увеличивается по сравнению с контролем в 1,35 раз- с 2,63 усл. ед. до 3,56 усл. ед.. Также c помощью t-критерия Стьюдента было показано, чтозначения КИ достоверно отличаются (p<0,05). В дополнительном эксперименте нами былопоказано отсутствие дозозависимого эффекта между концентрациями лиганда Shh 1 мкг/мл и3мкг/мл (данные не представлены).Добавление лиганда Shh в конечной концентрации 3 мкг/мл к культуре астроцитовчеловека также увеличивает пролиферацию клеток.
Но в сравнении с клетками глиобластомыU-251 MG в этом случае наблюдается не столь выраженное увеличение пролиферации.Достоверные отличия между образцами начинаются только через 52 часа после началакультивирования и продолжаются до окончания эксперимента (рис. 11). В присутствии Shhувеличение пролиферации астроцитов по сравнению с контролем отмечается в 1,23 раза призначениях КИ 4,51 и 3,68 усл. ед., соответственно (сравнение было выполнено на 52-ой часкультивирования). С помощью t-критерия Стьюдента было показано, что значения КИдостоверно отличаются (p<0,05). В дополнительном эксперименте нами было показаноотсутствие дозозависимого эффекта между концентрациями лиганда Shh 1 мкг/мл и 3мкг/мл(данные не представлены).Рисунок 11.
Зависимость КИ от времени культивирования с Shh для культурыастроцитов человека. Планки погрешностей отображают стандартное отклонение.Стрелкой отмечен момент начала достоверных отличий.61В эксперименте с культивированием клеток линии глиомы U-87 MG в присутствие Shh(конечная концентрация 3 мкг/мл и 1 мкг/мл) на протяжении всего эксперимента не былополучено достоверных отличий от контроля.
При этом контрольные и экспериментальныеклетки росли в присутствии 1,6% DMSO. Внесение DMSO обусловлено тем, что его добавлениеспособствует более быстрому выходу клеток на экспоненциальную фазу роста, что будетописано в экспериментах с ингибитором сигнального пути.
Так как графики зависимости КИ отвремени в данном случае не являются наглядными и представляют собой три пересекающиесялинии с пересекающимися планками погрешностей, мы представили данные в видегистограммы, отображающей значение КИ через 60 часов после начала эксперимента (рис. 12).Рисунок 12. Гистограмма, отображающая зависимость КИ от концентрации лигандаShh для клеток линии глиомы U-87 MG через 60 часов культивирования.
Планкипогрешностей отображают стандартное отклонение.Таким образом, добавление лиганда Shh приводит к увеличению пролиферации в большейстепени клеток линии глиомы U-251 MG и в меньшей степени клеток культуры астроцитовчеловека. При этом на пролиферацию клеток линии глиомы U-87 MG лиганд Shh не оказываетникакого эффекта.Изучение эффекта циклопамина на пролиферацию клетокКак было сказано выше, 5 мМ стоковый раствор циклопамина был разведен в DMSO.
Придобавлении в ростовую среду для клеток стоковый раствор циклопамина разводится в 1000 и500 раз, до конечной концентрации 5 мкМ и 10 мкМ. При этом концентрация DMSO в средесоставляла 0,1% и 0,2% соответственно. Ранее нами было замечено, что добавление DMSOспособствует повышению пролиферации клеток. Поэтому, чтобы оценить эффект циклопамина62на пролиферацию, контрольные клетки также выращивали в присутствии DMSO. Изначальноиспользовали 2 контрольных образца ростовой среды – с добавлением 0,1% и 0,2% DMSO дляэкспериментальных образцов с 5 мкМ и 10 мкМ циклопамина соответственно.
Но между собойэти данные оказалось неудобно сравнивать, поэтому мы оставили контроль только сдобавлением 0,2% DMSO, а в экспериментах с 5 мкМ циклопамина концентрацию DMSOувеличили с 0,1% до 0,2%.В экспериментальных образцах клеток культуры астроцитов человека, растущих в среде с5 мкМ и 10 мкМ циклопамина и 0,2% DMSO, на протяжении всего эксперимента не былополучено достоверных отличий от контрольного образца с добавлением в ростовую среду 0,2%DMSO. Также видно, что в контрольном образце в присутствии DMSO клетки пролиферируетактивнее, чем клетки, растущие в обычной ростовой среде (рис. 13).
Таким образом, вконцентрациях 5 мкМ и 10 мкМ циклопамин не влияет на скорость пролиферации клетоккультуры астроцитов человека.Рисунок 13. Зависимость КИ от времени культивирования с циклопамином длякультурыастроцитовчеловека.Планкипогрешностейотображаютстандартноеотклонение.Культивирование клеток глиомы линии U-251 MG в присутствии 5 мкМ и 10 мкМциклопамина приводит к снижению пролиферативной активности клеток. При концентрации 5мкМ достоверные отличия отмечаются в период с 40 до 83 часов после начала культивирования(рис. 14). Далее отмечается сближение кривых роста контрольного и экспериментальнойобразцов.
Но в контрольном образце значение КИ перестает меняться – рост клеток выходит на63плато, в то время как КИ экспериментального образца продолжает увеличиваться,следовательно, культура находится в фазе роста. При концентрации циклопамина 10 мкМдостоверные отличия от контроля отмечаются с третьего часа после начала культивирования инаблюдаются до конца эксперимента. Через 50 часов инкубации клеток с циклопамином КИоказался в 1,32 (5 мкМ) и 1,88 (10 мкМ) раза меньше, чем в контроле, и достоверно различаетсяв этих группах (рис. 14). Коэффициент корреляции Спирмена r = -0,95.Рисунок 14.
Зависимость КИ от времени культивирования с циклопамином длякультуры клетокглиомы линииU-251 MG. Планкипогрешностейотображаютстандартное отклонение.Нами было замечено, что в зависимости от концентрации DMSO в ростовой среде клеткиглиомы линии U-87 MG в разное время выходят в экспоненциальную фазу роста. Посколькукультура клеток U-87 MG обладает относительно слабой пролиферативной активностью, намибыла выбрана оптимальная концентрация DMSO, при которой клетки начинали быстреевыходить в экспоненциальную фазу роста. Концентрация DMSO в экспериментальных иконтрольных образцах составила 1,6%.Было показано, что добавление циклопамина к клеткам линии U-87 MG в концентрации 5мкм и 10 мкМ снижает пролиферативную активность.
При концентрации циклопамина 5мкМдостоверные отличия продолжаются с 51 часа до 92 часов от начала эксперимента, гдеотмечается выход кривой контрольных клеток на плато. Для концентрации 10 мкМдостоверные отличия начинаются с 30 часов и продолжаются до окончания эксперимента (рис.15).Для количественной оценки изменения пролиферации была выбрана точка 60 часоввместо 50 часов от начала эксперимента. Это связано с тем, что клетки линии U-87 MG позже64других культур выходят в экспоненциальную фазу роста. КИ в этой точке для клеток с 5 мкМ и10 мкМ циклопамина оказался в 1,16 и 1,65 раза меньше, чем в контроле и достоверноразличается в этих группах (рис.
15). Коэффициент корреляции Спирмена r = - 0,95.Рисунок 15. Зависимость КИ от времени культивирования с циклопамином длякультурыклетокглиомылинииU-87 MG.Планкипогрешностейотображаютстандартное отклонение.Таким образом, циклопамин в концентрациях 5 мкМ и 10 мкМ через сигнальный путь HHоказывает ингибирующее влияние на пролиферацию клеток линий глиом U-87 MG и U-251 MGи не оказывает влияния на клетки культуры астроцитов человека.3.3 Изучение цитотоксического действия циклопаминаСледует отметить, что используемые концентрации циклопамина 5 мкМ и 10 мкМ быливыбраны потому, что как показано в литературе, при этих концентрациях препарат ингибируетсигнальный путь, в то время как при больших концентрациях наблюдается его цитотоксическийэффект [93].В первую очередь мы решили изучить зависимость КИ от времени культивированияастроцитов с добавлением 20 мкМ циклопамина.
Культуру астроцитов человека выбрали, таккак при добавлении циклопамина 5 мкМ и 10 мкМ в ней не наблюдалось уменьшениепролиферации клеток вследствие ингибирования сигнального пути HH (рис. 13). Придобавлении 20 мкМ циклопамина, концентрация DMSO в ростовой среде составляет 0,4%.Такая концентрация DMSO была взята в контрольном исследовании. При добавлении65циклопамина в концентрации 20 мкМ было отмечено достоверное уменьшение клеточногоиндекса в сравнении с контролем (рис.
16).Рисунок 16. Зависимость КИ от времени культивирования с циклопамином длякультурыастроцитовчеловека.Планкипогрешностейотображаютстандартноеотклонение.Как видно, при концентрации циклопамина 20 мкМ в отличие от концентраций 5 мкМ и10 мкМ, кривые экспериментального и контрольных образцов не совпадают.
Криваязависимости КИ от времени экспериментального образца расположена ниже кривойконтрольного образца. Сравнивая кривые в этом опыте, мы не можем сделать однозначныйвывод о влиянии циклопамина на клетки: происходит ли уменьшение КИ в результатеингибирующего эффекта такой дозы циклопамина на сигнальный путь клеток, или наблюдаетсяцитотоксический эффект, который приводит к уменьшению клеточного индекса вследствиегибели клеток и их открепления от подложки.Для ответа на этот вопрос мы применили проточную цитометрию с использованием тестаопределения жизнеспособности клеток.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
