Э. Рис, М. Стернберг - Введение в молекулярную биологию от клеток к атомам (1160049), страница 25
Текст из файла (страница 25)
Для тогочтобы этот фермент функционировал, также в принципе требуется затравочная ДНК, однако здесь еевполне заменяет короткий отрезок двойной спирали,образуемый шпилькой. На одном из концов такой дцкДНК все еще остается одноцепочечная петля; онаудаляется с помощью фермента нуклеазы S1. Этотфермент разрезает петлю и, кроме того, подравниваетцепочки ДНК, удаляя всю оставшуюся оц-ДНК. После такой обработки кДНК можно встраивать в вектор.Вектор - это нечто вроде молекулярного «такси»,способного переносить чужую ДНК внутрь бактериальной клетки таким образом, чтобы она могла тамреплицироваться. Существует два основных типа век-торов: бактериальные плазмиды и бактериофаги.Здесь мы рассмотрим только первый тип.Плазмиды — это встречающиеся в клетках внехромосомные элементы, представляющие собой замкнутыекольцевые молекулы дц-ДНК (гл. 26).
Они способныреплицироваться независимо от геномной ДНК бактерий. Часто плазмиды содержат гены, белковые продукты которых обеспечивают нечувствительность к тем илииным антибиотикам. Этим свойством пользуются дляотделения бактерий, содержащих плазмиды («+»-бактерии), от «—»-бактерий, лишенных плазмид.
Чтобывключить кДНК в плазмиду, замкнутое кольцо плазмиды надо «разомкнуть». Для этого плазмиды подвергаютвоздействию рестриктаз.Рестриктаза - (гл. 18) разрезает дц-ДНК поопределенным нуклеотидным последовательностям,называемым участками рестрикции (обычно этокороткие па-линдромные последовательности); разныерестриктазы узнают разные палиндромы. В плазмидах,встречающихся в природе, часто бывает много такихучастков для каждой из рестриктаз.
Поскольку видеальном случае нам нужна одна-единственная точкаразреза, есть смысл в направленном отборе или«конструировании» плазмид с таким свойством.Например, в плазмиде pBR322, широко используемойв качестве вектора, для многих рестриктаз имеется лишьпо одному участку рестрикции; в ней также имеютсягены, обеспечивающие резистентность к ампициллинуи пенициллину; и в ней нет некоторых«несущественных» генов, имевшихся в ее прототипе.Оставлены лишь те гены, которые необходимы дляосуществления функций трансформации бактерий ирепликации плазмиды.Сшивание (лигирование) — процедура, в ходе которойчужеродная ДНК встраивается между (или сшиваетсяс) двумя концами плазмидной ДНК с помощьюфермента, называемого ДНК-лигазой. Чтобы эта операция могла осуществиться, необходимо, чтобы концы кДНК и плазмидной ДНК были «липкими». Дляэтого на концах должны быть оц-последовательности,способные образовывать комплекс друг с другом черезспаривание оснований и обеспечивающие сцеплениедвух пар концов.
Так образуется плазмида, котораяназывается рекомбинантной. Описываемая ниже процедура, с помощью которой это достигается, называется методом гомополимерных концов. Существует ещеодна процедура, называемая связыванием по сайтамрестрикции, но мы ее рассматривать не будем.Метод гомополимерных концов основан наприсоединении к 3'-концам цепей, образующих дцДНК, коротких отрезков оц-ДНК с регулярнойпоследовательностью(гомополимерных).Есликаждый подобный гомополимер состоит изнуклеотидов одного вида и если два такихгомополимера с взаимно комплементарнымиоснованиями присоединены соответственно кплазмиде и к кДНК, то последние, оказавшись рядом,замкнутся друг на друга с образованиемрекомбинантной плазмиды.Трансформация происходит после того, как рекомбинантную плазмиду добавляют к бактерии-реципиенту: плазмида проникает внутрь бактерии и включается в ее жизненный цикл.
Поскольку не всебактериальные клетки в реакционной смеси будуттрансформированы, желательно провести их отбор, стем чтобы размножаться могли лишь рекомбинантные бактерии. Отбор может быть основан на том, чтоплазмиды обеспечивают резистентность к тем илииным антибиотикам. Это означает, что только те бактерии, в которых есть плазмиды, будут размножатьсяв присутствии соответствующего антибиотика.Скрининг («просеивание») — это процедура,необходимость применения которой обусловлена тем,что в исходном препарате кДНК представлено многоразных мРНК и лишь часть плазмид несет нужныйнам ген.
Методики, которые при этом используются,слишком специальны, и мы не будем их здесь рассматривать; подробное описание их имеется в приложен-ных ссылках. Как только нужную нам бактерию удалось выделить, ее нетрудно клонировать и размножить в культуре. Это уже содержание следующего этапа, называемого амплификацией.Амплификация осуществляется благодаря тому,что в одной бактериальной клетке можетсинтезироваться много копий интересующей насплазмиды, а также за счет получения большогоколичества клеток с такими плазмидами. Послевыделения и очистки плазмиды обрабатываютсоответствующей рестриктазой, которая вырезаетвстроенные в них копии искомого гена. Амплифицированный таким образом ген можно использовать для дальнейших экспериментов в области геннойинженерии, аналогичных тем, что упомянуты в спискерекомендуемой литературы.
Кроме того, бактерииможно применять для получения белкового продуктагена, встроенного в плазмиду, если выполняются дваусловия: а) происходит транскрипция этого гена иб) нужный белок секретируется бактерией.31. Структура полисахаридовПОЛИСАХАРИДЫ — это длинные цепочки из моносахаридов, соединенных гликозидными связями. Нередко полисахариды имеют линейную структуру, номогут и ветвиться.
У растений и животных полисахариды играют структурную роль и служат резервнымвеществом. Наиболее распространенный моносахарид, чаще всего встречающийся в полисахаридах, —это шестиатомный сахар (гексоза) D-глюкоза. Из-заналичия разных способов связывания гексоз (типовгликозидной связи) и разных функциональных группструктура полисахаридов весьма разнообразна. Мырассмотрим только пять из множества полисахаридов.D-глюкоза — это шестиатомный моносахарид; егоструктура показана на рис.
31.2. Группа —ОН при атоме углерода 1 направлена либо вверх (т. е. в ту же сторону, что и атом углерода 6), и тогда образуется (β-Dглюкоза, либо вниз, и тогда получается а-D-глюкоза.Различие между этими родственными сахарами играетнаиболее важную роль при образовании из них полисахаридов. Гексозы (например, D-глюкоза) могутнаходиться в двух стабильных конформациях, представляющих собой две разновидности конформациитипа «кресла» (гл. 14): С1 и 1С. В состоянии С1 массивные ОН-группы параллельны плоскости сахарногокольца и направлены в стороны; о таких группахговорят, что они имеют экваториальную ориентацию.В состоянии 1С эти группы направлены вверх и внизотносительно кольца, т. е. имеют аксиальную ориентацию.
Так как кислород — это весьма большой атом,конформация С1 более предпочтительна, посколькупри этом крупные атомы располагаются далеко другот друга.Гликозидная связь образуется при взаимодействиидвух моносахаридов. Это эфирная связь, формирование которой сопровождается высвобождением молекулы воды (рис. 31.1). Существуют разные способыобразования гликозидных связей. В линейных полисахаридах она создается между атомом С одного сахарного остатка и либо третьим, либо четвертым углеродным атомом следующего остатка; при этом обасахара, как правило, находятся в С1-(экваториальной)конформации.
Гликозидные связи обозначаютсяследующим образом: (β(1 —> п) — это связь между атомом кислорода при атоме углерода 1 в (β-положениии углеродом п следующего сахара; в образовании свя-зи α(1 —> п) участвуют те же углеродные атомы, но теперь атом кислорода при углероде 1 занимает α-положение. Наиболее часто встречаются гликозидные связи β(1 —> 4) и β(1 —> 3) (примеры - целлюлоза игемицеллюлозы растений), а также α(1 ->4)и α(1 —> 6)[примеры — крахмал (растения) и гликоген (животные)]. Довольно редки связи типов (2 —> 1) и (2 —> 6);они обнаружены в таких соединениях, как фруктаны,содержащиеся в некоторых растениях.ЦЕЛЛЮЛОЗА состоит из полимерных цепочек молекул D-глюкозы (до 1000 звеньев), соединенных междусобой (β(1 —> 4)-гликозидными связями.
Эти цепочкиобъединяются, образуя волокна. Когда молекулыглюкозы, находящиеся в С1-конформации, образуютβ(1 —> 4)-цепочки, формируется β-структура. Связаноэто с тем, что сахарные остатки, соединенные гликозидными связями, теряют полную свободу вращениявокруг С1—О- и О—С4-связей из-за наличия массивных 6СН2ОН-групп, и полимер приобретает конформацию, благоприятную для образования межцепочечных водородных связей, в случае когда цепочкирасполагаются антипараллельно.Стенки растительных клеток состоят избольшого числа β-слоев, упакованных таким образом,что направления цепей в соседних слоях оказываютсяпротивоположными. В результате образованияводородных связей между слоями у растительныхклеток формируется прочная защитная многослойнаяоболочка.
Помимо целлюлозы стенки растенийсодержат ряд водорастворимых гемицеллюлоз,например поликсилозу (ксилан). Моносахаридксилоза - это D-глюкоза, у которой группа 6СН2ОНзамещена атомом водорода. У ксилана вращение неограничено, и он образует правую спираль с тремямономерными единицами на один виток. Еслипосмотреть на молекулы целлюлозы и ксилана вдольих длинных осей, то мы сразу поймем, почемуразличается растворимость этих двух компонентовклеточной стенки (рис.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
