Э. Рис, М. Стернберг - Введение в молекулярную биологию от клеток к атомам (1160049), страница 24
Текст из файла (страница 24)
Отсюда следует, чтоинициаторы — это белки, взаимодействующие с ДНКи переводящие ее в такое состояние, в котором онаспособна связывать ДНК-полимеразу.Деление клетки происходит, когда ее суммарная массадостаточна для двух клеток и когда завершилась репликация. Время, затрачиваемое на процесс деления, относительно постоянно и составляет около 20 мин.МИТОТИЧЕСКОЕДЕЛЕНИЕЭУКАРИОТИЧЕСКИХ КЛЕТОК включает в себя рядфаз клеточного цикла, которые в сумме для одногоцикла деления могут составлять около 24 ч.Интерфазасоответствует отрезку цикла, втечение которого ядерный хроматин распределен поядру и не удается выявить никаких признаковхромосом. Интерфазу подразделяют на четырепериода: Go, G 1, S и G2.Профаза следует за интерфазой и является тем периодом после G2, когда становятся различимыми конденсированные хромосомы.Митоз (М) — это период за профазой, во время которого происходит перестройка хромосом, завершающаяся образованием двух ядер и, наконец, двух дочерних клеток.
Выделяют три четко различимыхподпериода митоза, известных как метафаза, анафазаи телофаза.Фаза Go непостоянна по длительности. Клетка может перейти к ней сразу после деления. О клетке, находящейся в фазе Go, говорят как о покоящейся, т. е. опребывающей в неделящемся состоянии. Клеткимногих тканей взрослого организма находятся в основном именно в этом состоянии: в них не происходит репликации ДНК и может протекать лишь оченьслабый синтез РНК. На переход клетки в фазу G oвлияют такие факторы, как уменьшение количествапитательных веществ, межклеточное контактное ингибирование деления и внутриклеточные регуляторы(например, в некоторых условиях циклический AMP).Когда клетка, находящаяся в фазе Go, подвергаетсядействию определенных гормонов и других факторовроста, она может перейти из фазы G o в G1.Фаза G1 — это период, в течение которого клеткаготовится к началу синтеза ДНК, осуществляемого втечение фазы S.
Длительность фазы G| непостоянна(от нескольких часов до суток и даже больше). Почему это так, неизвестно, но при добавлении к клеткамв фазе G, гормонов продолжительность данной фазычасто уменьшается. Это можно объяснить увеличением скорости синтеза каких-то ключевых молекул поддействием гормонов. Зачастую гормон должен находиться в клетке или на ее поверхности по крайней мере в течение 8 ч, пока сможет начаться репликацияДНК.
Причина этого явления неизвестна. К концуфазы G1 клетка полностью подготовлена к переходу кS-фазе.Фаза S— это период, за который количество ДНКудваивается; он предшествует делению клетки на дведочерние. Длительность фазы S незначительно меняется от клетки к клетке и составляет около 6—8 часов.За репликацией ДНК можно следить, измеряя в этотпериод скорость включения в ДНК тимидина, меченного тритием (3Н-Т). Одновременно происходит синтез РНК. Если к клеткам, находящимся в S-фазе, добав ит ь 3 Н- ц ит идин, т о р а д и о а к т и в н а я РНКпоявляется вначале в ядре, а затем в цитоплазме.
ХотяРНК синтезируется во время всей интерфазы, наиболее интенсивно этот процесс протекает в S-фазе.Можно остановить клетки в S-фазе, если добавить ингибиторы, такие, как актиномицин D, который бло-кирует работу РНК-полимеразы, встраиваясь в ДНК(гл. 43). При этом клеточный цикл не может продолжаться, пока не завершится репликация ДНК. По завершении синтеза нуклеиновых кислот и после удвоения большинства других клеточных компонентовклетка переходит в фазу G2.Фаза G2 — это часть интерфазы, во времякоторой не происходит репликации ДНК и можетидти лишь очень слабый синтез РНК, т.
е. G2 — этонекий промежуточный период. В фазе G2 содержаниехромосом в клетке вдвое больше, чем в нормальнойдиплоидной клетке. Длительность фазы G2 примерно2—6 часов и относительно слабо зависит от типаклеток. В фазе G2 происходит конденсация хроматинаи исчезает ядерная мембрана. Между G2 и М клеткапроходит состояние профазы.В профазе высококонденсированные хромосомына самом деле оказываются состоящими из двух переплетенных, но раздельных структур, называемых хроматидами. Каждая хроматида — это завершенная копия двухцепочечной ДНК в комплексе с белками.
Вовремя профазы центриоли, которые ранее поделилисьс образованием меньших, дочерних, центриолей, расходятся к противоположным полюсам. Виден сложный пучок микротрубочек (гл. 39), выходящих из центриолей, который называется митотическимверетеном. Оно образовано микротрубочками, распо-ложенными между центриолями, и по форме напоминает яйцо.
Эта структура выполняет в клетке функцию строительных лесов. Когда клетка входит в митоз, хромосомы связываются с «лесами», а ядернаямембрана перестает быть видимой. Хромосомы прикрепляются к микротрубочкам своими центромерами.Митоз (М) подразделяется на три периода: метафазу,анафазу и телофазу.В метафазе хромосомы выстраиваются поперек митотического веретена, образуя метафазную пластинку.Механизм, лежащий в основе этой ориентации, неизвестен.В анафазе хромосомы разделяются на составляющиеих хроматиды. Каждая из хроматид от каждой парыдвижется к тому или другому концу митотического веретена. Движение хроматид, называемых теперь дочерними хромосомами, обусловлено сокращениеммикротрубочек, но детальный механизм этого процесса неизвестен.
После завершения разделения хроматид клетка входит в телофазу.В телофазе хроматиды деконденсируются, образуядисперсный хроматин, и формируются ядерные мембраны. Митотическое веретено разрушается, а плазматическая мембрана перетягивается. В результатеполучаются две дочерние клетки. Затем каждая дочерняя клетка переходит в новый клеточный цикл в фазеGo или G1, и весь процесс повторяется.30.
Генная инженерия:клонирование геновКлонирование генов – это процедура, включающаявыделение и амплификацию отдельных генов в реципиентных клетках, про- или эукариотических. Этиклетки, содержащие нужный нам ген, можно использовать для получения либо а) большого количествабелка, кодируемого данным геном, либо б) большогоколичества самого гена в высокоочищенном виде. Внастоящее время используют две схемы клонирования гена. Согласно первой из них, геномную ДНКсначала расщепляют случайным образом с помощьюрестрицирующих эндонуклеаз (см.
ниже) на небольшие фрагменты примерно такой же длины, что и ген.Далее каждый фрагмент вводят с помощью вектора вреципиентную клетку, которая затем размножается,амплифицируя при этом ген или гены, содержащиесяв данном фрагменте. К этой методике мы больше возвращаться не будем. Согласно второй схеме, с инфор-мационной РНК, выделяемой из однотипных клетокорганизма, снимают ДНК-копии (кДНК), которыезатем вводят в реципиентные клетки, в среднем по одному гену на клетку, и амплифицируют тем же способом, что и в первом случае.Реципиентные клетки, т.е. клетки, выбранные дляклонирования гена, могут быть как про-, так и эукариотическими. Чаще всего для этой цели используютбактерии, поскольку их легко получать в большом количестве. Если, однако, ген был выделен из клетокмлекопитающих по первой методике, то его нужноклонировать в клетках эукариот, например в клеткахдрожжей, из-за неспособности ДНК, содержащей интроны (гл.
27), экспрессироваться в прокариотической клетке. Рассмотрим теперь вторую методику.Матричную (информационную) РНК (мРНК) выделяют изклеток или тканей, в которых экспрессиру-ется искомый ген. Так, для клонирования проинсулинового гена следует использовать (3-клетки поджелудочной железы, так как именно для них характерновысокое содержание проинсулиновой мРНК. Суммарную клеточную мРНК с помощью центрифугирования в градиенте сахарозы можно разделить на фракции, впрочем, довольно сильно перекрывающиеся.При такой грубой очистке число посторонних молекул мРНК в препарате уменьшается. Затем с молекулмРНК, попавших в нужный нам диапазон молекулярных масс (для белка таких размеров, как проинсулин,длина соответствующей молекулы мРНК составитпримерно 25 000 нуклеотидов, или 25 т.п.н.), снимаются ДНК-копии.Синтез ДНК - копий осуществляется ферментом,называемым обратной транскриптазой, или ревертазой (еще одно его название — РНК-зависимая ДНКполимераза), который выделяют обычно из соответствующих РНК-содержащих вирусов.
Чтобы этотфермент начал работать, требуется короткая (около 10нуклеотидов) одноцепочечная ДНК-затравка; дляэтой цели, как правило, используют oligo(dT). Затравочная ДНК самопроизвольно образует двухцепочечный комплекс с отрезком poly(dA), который всегдаприсутствует на З'-конце молекул эукариотическоймРНК (гл. 22). По завершении стадии копированияисходную цепь РНК разрушают (деполимеризуют).ДеполимеризациюисходнойРНК-цепочкиосуществляют путем щелочного гидролиза. Цепи ДНКустойчивы к обработке щелочью, а РНК полностьюде-полимеризуется. Получившаяся в результате ДНКявляется одноцепочечной (оц), лишь на конце молекулы образуется «шпилька» с небольшой петлей. Такая шпилька образуется потому, что на 5'-конце большинства мРНК имеется последовательность, однаполовина которой комплементарна другой (палиндром) и которая в результате копирования оказывается и в кДНК. Таким образом, концевой участок цепочки кДНК, где расположена эта последовательность,может замыкаться сам на себя с образованием петли иотрезка двойной спирали.Двухцепочечную (дц) кДНК получают путем достраивания оц-кДНК до двухцепочечной формы, выполняемого ферментом ДНК-полимеразой I.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
