Автореферат (1155053), страница 3
Текст из файла (страница 3)
Размер ТИА инкапсулированных и свободных эритроцитов, экспериментально устанавливался с помощью спектра мутности.Определение размера и физико-химических свойств эритроцитов (радиус эритроцитов, концентрация эритроцитов в 1 см3, проницаемость мембран эритроцитов, показатель среднегообъёма инкапсулированных эритроцитов, расчет площади поверхности эритроцита, толщина иобъем эритроцитов) рассчитывали с помощью известных формул.Определение осмотической резистентности ТИА загруженных эритроцитов вычисляли попроценту гемолиза по известной методике и рассчитывали по формуле.Характеристики разработанных методик количественного определения VCR и VLB в субстанциях и лекарственных формах оценивали согласно ОФС ГФ XIII изд.
«Валидация фармакопейных методик». Статистическую обработку экспериментальных данных проводили фармакопейным методом по ОФС «Статистическая обработка результатов химического эксперимента») ис помощью программы «Statistica - 7.0».1.Разработка методик спектрофотометрического определения ТИАВ эксперименте для изучения спектральных характеристик ТИА в ультрафиолетовой области были сняты спектры поглощения стандартных растворов VCR и VLB сульфатов (25 мкг/мл) вразличных растворителях (таблица 1).Таблица 1.
Спектральные характеристики VCR и VLB сульфатов в различных растворителяхРастворительМетанол (J.Ph.XVII; E.Ph)Вода очищенная0,1 М NaOH0,1 М HClФосфатный буфер (pH=5)Этанол 95%ХлороформVCR сульфат λ(max) нм222 ± 2256 ± 2298 ± 2219 ± 1254 ± 1295 ±1218,5 ± 1254 ± 1297,5 ± 1219 ± 1254 ± 1295,5 ± 1223 ± 1255 ± 1295,5 ± 1226 ± 1256 ± 1297 ± 1241 ± 1291 ± 1299 ± 1VLB сульфат λ(max) нм214 ± 2266 ± 2214 ± 1268 ± 1214 ± 1268,5 ± 1214 ± 1268 ± 1222 ± 1269 ± 1214 ± 1265 ± 1249,5 ± 1290,5 ± 1Установлено, что максимумы поглощения для водных растворов VCR и VLB сульфатовнаходились при 219±1, 254±1, 295±1 нм и при 214±1, 268±1 нм соответственно. В качестве оптимального растворителя для разработки методики количественного определения (аналитическиемаксимумы - 295 нм для VCR и 268 нм для VLB) была выбрана вода очищенная, как наиболеедешевый, безопасный и доступный растворитель.Для исследования аналитической области методик готовили ряд рабочих растворов (раствор Б) из стандартного раствора (раствора А) в диапазоне концентраций 1-250 мкг/мл (рис.
1).9AbsРисунок 1. УФ-спектры растворов калибровочного графикаВ полученных результатах показано, что оптимальной аналитической областью для количественного определения является интервал концентраций от 5 до 50 мкг/мл, т.к. показатель оптической плотности находится в диапазоне 0,1-1,0. На основе полученных данных (рис. 1) построены калибровочные графики.
Параметры линейных зависимостей представлены в таблице 2.Таблица 2. Параметры калибровочных графиков VCR и VLBПараметр линейностиКоэффициент - аКоэффициент - bУравнения регрессииКоэффициент корреляцииSDТеоретический предел обнаружения, мкг/млПредел количественногоопределния, мкг/млЕ1%1смVCR0,019540,01120y = 0,0195x + 0,01120,999850,00538VLB0,019230,01153y = 0,0192x + 0,01150,999910,004382,1082,0226,3896,126201,0191198,0615Оценку методик проводили в соответствии с требованиями ГФ РФ XIII (ОФС.1.1.0012.15).Для определения прецизионности методики использовали три серии растворов на трех уровняхконцентраций изучаемых веществ 10, 25 и 40 мкг/мл. Точность методик определяли путем добавления стандартного количества VCR и VLB в растворы для образцов 50 мкг, 125 мкг и 250 мкг.Предел обнаружения для VCR и VLB вычисляли по уравнениям калибровочных графиков.
Робастность методик устанавливали по влиянию pH среды (буферные растворы с pH = 3 – 10) на результаты измерений. Результаты представлены в таблице 3.Таблица 3. Результаты оценки разработанных методик спектрофотометрического определения ТИАПараметр аналитической методикиПрецизионностьПравильностьVCRVLBRср (%)=100,08;SD = 1,9658; RSD=0,01964Rср=100,32%;SD = 0,2539; RSD = 0,0025Rср (%)=100,17;SD = 0,9258; RSD = 0,00924Rср= 100,14%;SD = 1,1733; RSD = 0,01210Экспериментально установленныйпредел обнаружения, (мкг/мл)ВоспроизводимостьРобастность1,42261,2205̅ = 100,09%;̅ = 100,03%;SD = 0,29173; RSD = 0,00292SD = 0,34024; RSD = 0,0034̅ ± ∆х̅ = 100,09 ± 0,36 %;̅ ± ∆х̅ = 100,03 ± 0,42%;ХХР = 95%; ξ = 0,81026%Р = 95%; ξ = 0,9456%Положение максимума поглощения остается стабильным в интервалеот 3,0 до 7,0 единиц рНТаким образом, осуществлена разработка и оценка спектрофотометрических методик количественного определения ТИА (на примере VCR и VLB сульфатов).
Разработанные методики далееиспользованы в работе для определения VCR и VLB сульфатов в лекарственных формах, а такжеполученных клеточных формах препаратов и биологическом материале.2.Разработка методик количественного определения ТИА в биологическом материалеОпределение оптимальных условий удаления белка. В результате выполненных исследо-ваний было установлено, что наиболее полное осаждение белка плазмы крови и гемолизата клетокнаблюдается при использовании 30% раствора трихлоруксусной кислоты. Исследования показали,что, как для плазмы крови, так и для гемолизата клеток, оптимальное соотношение осадителя ибиоматериала составляет 1:1, а наилучшее время центрифугирования составляет 5 мин при 8000об/мин (таблица 4).Таблица 4.
Результаты выбора оптимальных условий удаления белкаОптическая плотность (λmax -280 нм)Плазма кровиГемолизат клетокСпособ осажденияКипячение в течение 10 минут0,3540,38410% раствор хлорной кислоты0,3300,36320% раствор хлорной кислоты0,2160,24530% раствор хлорной кислоты0,1290,16010% раствор цинка сульфата +0,2580,2960,1 М раствор гидроксида натрия10% раствор трихлоруксусной кислоты0,2440,30220% раствор трихлоруксусной кислоты0,1630,20130% раствор трихлоруксусной кислоты0,0590,103Соотношение осадителя и биоматериалаОстаточная оптическая плотность0,5:10,8930,9140,75:10,3340,3531:10,0710,1011,5:10,0680,087Время центрифугирования, мин30,3360,35350,0690,103100,0690,109150,0680,102Параметр методикиБыло установлено, что действием 30% раствора трихлоруксусной кислоты не удаётся полностью избавиться от эндогенных компонентов биоматериалов, мешающих определению изучаемых11представителей ТИА. В связи с этим была исследована возможность выделения ТИА методомгель-хроматографии.Выбор оптимальных условий гель-хроматографического выделения ТИА.
В эксперименте использовали различные марки Сефадекса (G-25, G-50, G-100). В качестве элюентов использованы вода очищенная, растворы натрия хлорида, натрия гидроксида и кислоты хлористоводородной различных концентраций (рис. 2). При этом установлены объёмы выхода ТИА, которыеявились одним из параметров в дальнейшем определении оптимальных условий выделения препаратов из биологического материала. Полученные результаты хроматографического поведенияизучаемых препаратов показаны в таблице 5.Таблица 5. Характеристики хроматографического элюирования ТИА препаратов*№ колонкиЭлюентVо, млСкорость элюента,мл/чНайдено (m)мкг%VCR5410994,28899,435812990,68299,07468989,25698,935010991,63999,16VLBIВода очищенная5210997,68499,77II0,1 М HCl5010992,42299,24III0,1 М NaOH488995,20699,52IV0,01 M Na-Фосфатный буфер5612990,44999,05*Тип геля - Сефадекс G-25; длина слоя геля (см) – 10; добавленные количества VCR и VLB – 1000 мкг.Результаты эксперимента аналогичны для всех изучаемых ТИА.IIIIIIIVВода очищенная0,1 М HCl0,1 М NaOH0,01 M Na-Фосфатный буферТИА препараты VCR и VLB хорошо растворяются в воде очищенной, а полученные результаты показывают высокую степень их вымывания из колонки.
Вода очищенная является дешевыми эффективным элюентом для изолирования ТИА препаратов при помощи Сефадекс G-25 (рис. 2).Рисунок 2. Элюентные хроматограммы ТИА после оптимизации хроматографической колонки123. Получение клеточных носителей для направленного транспорта в организме ТИА препаратов VCR и VLBИзучение взаимодействия ТИА препаратов VCR и VLB с компонентами плазмы иформенными элементами крови in vitro. Для изучения взаимодействия VCR и VLB с плазмой иформенными элементами крови, приготовлены 3 типа модельных образов: Модельный образ А (Кровь + препараты); Модельный образ Б - (Плазма + препараты); Модельный образ В – (Эритроциты + препараты).
Результаты приведены в таблице 6.Таблица 6. Количественное содержание свободного препарата в гемолизате№коLлонки (см)Взято для приготовления модельного образца (мкг)Найденоm (мкг)mср.(мкг)mср, %Метрологические характеристикирезультатов определенияVCRIIIIII10105,1100010001000341,422375,738346,181IV5,11000359,291IIIIII5,15,1105005001000216,564214,421444,285IV101000422,920358,58035,86352,73635,27y = 0,0195x + 0,0112̅ = 35,57 %SD = 1,5372; RSD = 0,04322̅ ± ∆х̅ =35,57 ± 2,44 % P = 95%Хξ = 6,8721 %VLB215,49343,10433,60043,36y = 0,0192x + 0,0115̅ = 43,23 %SD = 0,9023; RSD = 0,0209̅Х ± ∆х̅ =43,23 ± 1,43 % P = 95%ξ = 3,3189 %Обнаруженное содержание свободного VCR в гемолизате (таблица 6) в среднем составило35,57% ± 2,444 (относительная погрешность (ξ) = 6,8721 %; P = 95%) и VLB - 43,23% ± 1,4347%(относительная погрешность (ξ) = 3,3189%; P = 95%) от вводимой дозы.Изучение взаимодействия ТИА VCR и VLB с компонентами плазмы крови.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
