Автореферат (1154739), страница 2
Текст из файла (страница 2)
Сравнить выраженность воспалительной реакции стенки мочевого пузыря иокружающих тканей при подшивании к его стенке мембран, изготовленных из коллагена I типа,выделенного из тканей свиньи и крупного рогатого скота.2. Провести сравнительную оценку способности свиных и бычьих коллагеновыхмембран инкорпорироваться в состав стенки мочевых путей после заместительной пластики.3. Оценить гистологические изменения в зоне имплантации свиных и бычьихколлагеновых мембран, как в прилежащих отделах стенки мочевого пузыря и уретры, так и вимплантатах.4.
Изучить влияние включения в состав коллагеновых мембран кондиционированнойсреды культивирования мезенхимальных стволовых клеток жировой ткани человека нарегенерацию новообразованной стенки мочевого пузыря после его резекции.5. Оценить выраженность васкуляризации и клеточный состав имплантированных вмочевой пузырь коллагеновых мембран, содержащих и не содержащих кондиционированнуюсреду культивирования мезенхимальных стволовых клеток жировой ткани человека.6. Сравнить функциональное состояние резецированного мочевого пузыря после6заместительной цистопластики коллагеновой мембраной, содержащей и не содержащейкондиционированную среду культивирования мезенхимальных стволовых клеток жировойткани человека, а также при простом ушивании резецированного мочевого пузыря.Научная новизна.
Получены приоритетные данные о биологических свойствах мембраниз коллагена I типа выделенных из тканей свиней и крупного рогатого скота. Выявленыпреимущества использования мембран из свиного коллагена. Доказано, что включение в составколлагеновой мембраны кондиционированной среды культивирования мезенхимальныхстволовых клеток человека способствует более полноценной эпителизации имплантата,ускорениюегореваскуляризации,более полноценнойрегенерациимышечногослояновообразованной стенки мочевого пузыря и препятствует инкрустации солей мочи нанеэпителизированной внутренней поверхности. Выявлено более полноценное восстановлениефункционального объема органа и его комплаентность, оцененные методом инфузионнойцистометрии, при включении в состав мембраны кондиционированной среды культивированиямезенхимальныхклиническогостволовыхпримененияклетокжировойколлагеновоготканиимплантатачеловека.дляДоказанавозможностьзаместительнойпластикимочеточника.Теоретическая и практическая значимость.
Доказана эффективность использованияметодики цистопластики для изучения пригодности различных коллагеновых биоматериаловматериалов для заместительной пластики мочевых путей. Определен оптимальный видколлагена, вызывающий минимальную воспалительную реакцию окружающих тканей, которыйможет быть рекомендован для изготовления материала для цистопластики. Обоснованацелесообразность включения в состав коллагеновых мембран кондиционированной средыкультивирования мезенхимальных стволовых клеток жировой ткани человека для обеспеченияполноценной регенерации стенки мочевого пузыря и сохранения ее функции.
Проведенаапробация заместительной пластики мочевых путей в клинике с использованием биопротезамочеточника из коллагенаI типа. Сформулированы рекомендациипо дальнейшимисследованиям возможности использования коллагеновых материалов для расширяющейцистопластики, в том числе и в клинической практике.Методология и методы исследования. Экспериментальные исследования проведены на48 Ново-Зеландских кроликах-самцах массой 3-3,5 кг. Животных содержали в стандартныхусловиях вивария на рационе из специального комбикорма с неограниченным доступом к воде.Проведено 6 серий экспериментов:1-я серия – сравнительная оценка биосовместимости препаратов коллагена I типа,изготовленного из тканей крупного рогатого скота (бычий коллаген) и свиней, на модели ихподшивания к наружной стенке мочевого пузыря (12 экспериментов);72-я серия – сравнительная оценка способности к интеграции в ткань мочевого пузырямембран, изготовленных из бычьего или свиного коллагена I типа, после замещения имидефекта его стенки (18 экспериментов);3-я серия – изучение возможности заместительной пластики уретры трубчатымпрепаратом коллагена I типа (4 эксперимента);4-я серия – оценка возможности использования нативных мембран из свиного коллагенаI типа для заместительной пластики мочевого пузыря после его резекции (5 экспериментов);5-я серия – оценка коллагеновых мембран, содержащих кондиционированную средукультивирования мезенхимальных стволовых клеток жировой ткани человека, в качествематериаладлязаместительнойпластикимочевогопузыряпослеегорезекции(5экспериментов);6-я серия – резекция мочевого пузыря с его ушиванием (4 эксперимента).Из эксперимента животных выводили на 3-и, 7-е, 14-е, 21-е и 30-е сутки после операции.Коллагеновые мембраны были приготовлены по следующей методике.
Стерильныйпрозрачный нейтральный раствор коллагена I типа, выделенный из тканей животных(«ВИСКОЛЛ», производство ООО «Имтек», Россия), в объеме 1 мл помещали в стерильнуюкультуральную чашку с площадью поверхности 2 см2. Затем чашку перемещали в CO2инкубатор и инкубировали при +370 С до тех пор, пока не формировался гидрогель, который вдальнейшем подвергался сушке в асептических условиях при температуре от +200С до +250С втечение 7 дней. Процесс сушки считался полностью завершенным, когда гидрогель переходил вформу жесткого стеклоподобного материала. Полученные таким образом мембранырасфасовывали в индивидуальную стерильную упаковку с соответствующей маркировкой.Мезенхимальные стволовые клетки (МСК) выделяли из подкожного жировогоотложенияздоровыхдоноровобоихполов,полученногоприпроведениималогохирургического вмешательства под местной анестезией или в ходе плановых хирургическихопераций.
Полученный в результате операции биоматериал в стерильных условияхламинарного бокса измельчали сосудистыми ножницами до консистенции суспензии мелких(размером не более 2 мм3) кусочков и смешивали с растворами ферментов коллагеназы I типа(200 ед/мл, «Worthington Biochemical», США) и диспазы (40 ед/мл, «Sigma», Германия) присоотношении объема ткани (в мл) к объему ферментативного раствора (в мл) 1:2. Образецинкубировали при 37°C в течение 30-45 мин при постоянном встряхивании. По окончанииинкубации добавляли равный объем среды роста МСК и центрифугировали при 200 g в течение8 мин.
Белесый поверхностный слой, состоящий из зрелых адипоцитов и кусочковферментативно необработанной ткани, удаляли с помощью вакуумного насоса, а осадок,состоящий из клеток стромы жировой ткани, клеток сосудистой стенки и крови,8суспендировали в стерильной деионизированной воде для лизирования эритроцитов. Чтобывосстановить осмотическое давление, добавляли соответствующий объем 10-кратногофосфатного буфера, а затем фильтровали через нейлоновые фильтры с размером пор 100 мкм(«BD Falcon Cell Strainer», США) и центрифугировали при 200 g 5 мин. Супернатант удаляли, аосадокресуспендироваливсреде,поддерживающейростнедифференцированныхмезенхимных прогениторных клеток человека (Advance Stem Cell Basal Medium, далее –AdvanceSM, «HyClone», США), содержащей 10% смеси факторов роста (Advance Stem CellGrowth Supplement, «HyClone») и 100 Ед/мл пенициллина/стрептомицина («HyClone»).Выделенные клетки высаживали на чашки Петри («Corning», США) в концентрации 5х10 4/см3 иинкубировали в СО2–инкубаторе (5% СО2; 95% воздуха) при 37°С.
На следующий день вчашках меняли среду для удаления не прикрепившихся клеток. Смену среды проводили каждые2-3 дня; при достижении 70-80% конфлюента клетки рассаживали в соотношении 1:3 сиспользованием раствора QTase (HyClone). Жизнеспособность клеток оценивали путем окраскиклеток раствором трипанового синего и подсчета количества живых и мертвых клеток спомощью счетчика клеток (Cell Counter, «Invitrogen», США).Для получения кондиционированной среды МСК жировой ткани 4-5 пассажа, достигшие80% конфлюента, промывали трехкратно раствором Хэнкса («ПанЭко», Россия).
К чашкамдобавляли среду DMEM-LG. Клетки культивировали в течение 7 дней, после чегокондиционированнуюсредусобирали,очищалиотклеточногодебрисапутемцентрифугирования в течение 10 мин при 300g, затем концентрировали в 50 раз с помощьюультрафильтрации через мембраны из регенерированной целлюлозы с указанным отсечением10 кДа в центрифужных картриджах («Millipore», США).Для получения биоматериала смешивали 2,5% свиной стерильный нейтральныйколлагеновый гель («ИМТЕК», Россия)с образцами концентрированной в 50 разкондиционированной среды (КС) МСК жировой ткани в соотношении по объему 4:1.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
