Диссертация (1154377), страница 22
Текст из файла (страница 22)
Для биорегуляторов характерноспецифическое действие преимущественно на те органы, из которых ониполучены [343, 344, 345]. Показано, что применение биорегуляторов в качествелекарственных средств способствует восстановлению метаболизма в клеткахтканей, что приводит к ускорению процесса реабилитации пациентов послеперенесённыхмеханизмызаболеванийдействия[346,347, 348,349].регуляторныхОбсуждаютсяпептидов,средивероятныекоторых–166дистантнаяпередачасигнала в водной среде от молекул лиганда (ПЛС) крецепторам (клеткам-мишеням) [350,351].Размер частиц является одним из важнейших показателей качествадисперсных систем, в том числе и растворов пептидов.
В настоящее времямногие производители ПЛС в целях продвижения их на фармацевтическийрынок представляют свой продукт как растворы наночастиц, обладающихвысокой биологической активностью [352]. Однако исследования показывают,что в растворах пептидов присутствуют, также субмикронные агрегаты[353,354]. Широко используемым методом в исследованиях агрегации пептидовявляетсядинамическоесветорассеяние(ДСР),посколькупроявлениебиорегуляторами адгезивных свойств препятствует их качественному иколичественному анализу другими физико-химическим методами.Для выделения регуляторных пептидов экстракцией физиологическимраствором (Т=40С) использовали измельчённые ткани печени крыс. Экстрактыцентрифугировали (3000 g, 20 мин) и отделяли надосадочную жидкость(супернатант/supernatant), в которую вносили сухой сульфат аммония(NH4)2SO4 (марка «хч», 76г на 100г раствора).
Образовавшийся солевой растворбелков оставляли на 76-80 часов при 40С. Выпавший осадок примесных белковотделяли центрифугированием. Собирали фракцию супернатанта, раствордиализовали до отрицательной реакции на NH4+-ионы. Содержание белка вофракциях определяли по уравнению Кристиана – Варбурга (Christian Warburgequation), основанному на cпектрофотометрическом определении белкав присутствии нуклеиновых кислот [355]:%Содержание белка (мг/мл) = Е%см · Аbs280 ‒ Есм · Аbs26050,где, Аbs280 ‒ поглощение белками при 280нм, Аbs260 ‒ поглощениенуклеиновыми кислотами при 260нм.Исходная концентрация белка в супернатанте печени крыс (СПК)составляла 0,1 мг/мл.
Методом динамического светорассеяния контролировали167размер агрегатов в растворах СПК следующих разведений (мг/мл): 2·10-4; 1·10-3;размер частиц, нм1·10-2; 1·10-1(рис. 36).40020001E-41E-30,010,1С, мг/млРисунок 36. Распределение частиц биорегулятора по размерам в растворахразной концентрации (n=5, X ± SD). Растворитель — 0,05 моль/л растворфосфатно-боратного буфера, рН 7,4—7,6.Методом ДРС выявлены пептиды, находящиеся в мономерном иагрегатном (олигомерном) состояниях. Видно, что увеличение концентрациибелка в СПК приводит к агломерации частиц: в растворах концентрацией 0,01мг/мл и 0,1 мг/мл размер агрегатов значительно превышает 100 нм и достигает500нм[356].ПрименениеметодаДСРдаетвозможностьпровестиэкспериментальный анализ существующей связи между размерами агрегатапептида, его биологической активностью и эффективностью интернализациипептидов клетками [357].1683.4.4.2.
Дисперсность пептидов синтетического происхожденияМодельюбиологическиактивныхпептидоввыступалирастворысинтезированных пептидов (СП). Структура синтезированных пептидов:пептид,состоящийизвосемнадцатиаминокислотныхостатков(А4):IAEIPTQKPAADVQFGSL – Изолейцил–аланил–глутамил–изолейцил–пролил–треонил–лутаминил–лизил–пролил–аланил–аланил–аспарагил-валилглутаминил-фенилаланил-глицил-серил-лейцил.Пептид,состоящийиздвенадцати аминокислотных остатков (А2): LNVVIGKHGLL – Лейциласпарагинил-валил-валил-изолейцил-глицил-лизил-гистидил-глицил-лейциллейцил.
Исходная концентрация пептида составляла С=1 мг/мл. Былиприготовлены, также, разведения: 0,1 мг/мл, 0,01 мг/мл. Растворитель ─ 0,05моль/л раствор фосфатно-боратного буфера рН 7,4-7,6. Результаты анализапредставляют собой гистограммы численного и объёмного распределениячастиц в растворах пептидов по размеру (рис. 37).Видно, что в растворе пептида А-4 наибольшая объёмная доля частицсоответствует размерным группам с максимумами около 50 нм, 300 нм и 700нм, очевидно, являющиеся молекулярными ассоциатами. Объемная доля такихчастиц варьируется от 4 % до 12 % (см. рис.
42. 1). Однако, численная долякрупных частиц в интервале размеров от 300 нм до 1000 нм наименьшая (около1%), наибольшее число присутствующих в растворе пептида А-4 частиц сразмерами 50 нм и 150 нм – 12 % и 16 % (от общего числа всех частиц) (см. рис.37.2). В растворе пептида А-2 как по объёмной доле, так и по числу частицразмерная группа в области от 1-3 нм имеет максимальное значение (см.
рис.37.3 и 37.4). Следовательно, исследуемые образцы концентрации 1мг/млразличаются численным и объёмным распределением частиц. В каждом израстворовнаблюдаетсяразличаются по размеру.адгезиячастиц,образующиесяконгломераты1691234Рисунок 37. Гистограммы объемного (1 и 3) и численного (2 и 4) распределения частиц в растворах синтезированныхпептидов исходной (1 мг/мл) концентрации по данным ДРС-метода: А4 – 1 и 2; А2 – 3 и 4 (n≥3, X ± SD).170Изучались,также,десяти‒истократныеразведениярастворовсинтетических пептидов (рис. 38 и рис. 39). Так в растворе пептида А‒4концентрацией 0,1 мг/мл наблюдается присутствие размерных групп частиц смаксимумами 100 нм и 1000 нм и объемными долями 1 % и 8 % соответственно(см.
рис. 38.1). Однако, численная доля микронных агрегатов, как и в случаеисходной концентрации раствора пептида, ничтожно мала (см. рис. 37.3 и 38.3):в растворе преобладают частицы с размером до 1 нм, меньшее число частицразмером около 100 нм, а частицы субмикронного и микронного размерапрактически отсутствуют. В растворе пептида А‒2 объёмное и численноераспределения совпадают: наибольшее число частиц размером около 0,6 нм(см. рис. 38. 3 и 38.4).Для определения пептидов, находящихся в мономерном состоянии,проводили измерения 0,01 мг/мл растворов (см.
39). Объёмноераспределениечастиц пептида образца А‒4 ‒ одномодальное в области 0,6 нм (см. рис. 39.1 и39.2). Для образца А-2 распределение бимодальное, кроме размерной группы0,6 нм появляется доля частиц с размером 2,5 нм (см. рис. 39.3 и 39.4). Какпоказывают диаграммы численного распределения, в растворе пептида А‒4максимальное число частиц с размером 0,6 нм, а в растворе пептида А‒2, кромеразмерной группы 0,6 нм, присутствуют мономеры с размером, примерно, 2 нм.1711324Рисунок 38. Гистограммы объемного (1 и 3) и численного (2 и 4) распределения частиц в растворах синтезированныхпептидов концентрации 0,1 мг/мл по данным ДРС-метода: А4 – 1 и 2; А2 – 3 и 4 (n=3, X ± SD).1721324Рисунок 39. Гистограммы объемного (1 и 3) и численного (2 и 4) распределения частиц в растворах синтезированныхпептидов концентрации 0,01 мг/мл по данным ДРС‒метода: А4 – 1 и 2; А2 – 3 и 4 (n=3, X ± SD).173Использование метода ДРС для определения размера пептидов в растворахразличных концентраций дает возможность анализа механизма транспорта,следовательно, эффективности интернализации пептида в клетки [358].3.4.5.
Типирование бактериальных штаммов на примере EscherichiacoliОбнаруженаспособностьобразовыватьполицеллюлярные(«надклеточные») формы у бактерий различных видов, имеющих патогенноезначение для человека и животных, в том числе «энтеровирулентные» штаммыEscherichia coli. [359].На сегодняшний день Escherichia coli – наиболее широко изученныйорганизм, хорошо приспособленный к росту в лабораторных условиях ииспользуемый в качестве модельного организма в микробиологическихисследованиях[360].Представляетинтересизучениеорганизациижизнедеятельности с позиции образования «ложной многоклеточности» упрокариота, постоянно взаимодействующих друг с другом и окружающейсредой.
Описание образования полицеллюлярных форм интересны, поскольку,в них уже интегрированы взаимодействия многих макромолекул, вдольлинейных структур которых могут передвигаться сигналы за счёт ассоциации идиссоциациимолекул[361].Вработах[362,363]показаноучастиеспецифических поверхностных образований бактериальных клеток (жгутики,адгезивныефимбрии,конъюгативныепилиидр.)вформированииполицеллюлярных ассоциатов. Однако, остается неясной конкретная роль такихструктурных образований на различных этапах пространственной организации.Объектами исследования выступили клетки штамма АР132, являющиесяпроизводными культивированного в жидкой питательной среде штаммаEscherichia coli K12 из коллекции культур музея штаммов кафедры биологии иобщей генетики РУДН.
Изучались как бесплазмидные бактерии, так ибактерии, содержащие F-подобные плазмиды рАР22-2 и рАР42, маркированные174путем включения в их структуру транспозонов Tn1 и Tn9 с генамиустойчивости к ампициллину и хлорамфениколу [364].В настоящие время одним из наиболее перспективных методическихподходов к изучению полицеллюлярных форм бактерий является малоугловоерассеяниелазерногоизлучения,чтопозволяетполучитьданныеоморфофункциональном состоянии бактериальных популяций при анализераспределения клеток по размерам и форме [365].
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
