Диссертация (1154338), страница 19
Текст из файла (страница 19)
14, рис. 12), уровни TNF и IL-1.Таблица 14. Влияние нифедипина на морфофункциональные показателиперитонеальных фибробластов (M±m)ПоказателиМИфибробластов, %Количество Ki67+ клеток, %Оксипролин,мкмоль/лГиалуроноваякислота, ммоль/лКонтроль12,3±0,4Нифедипин (конц.)0,00005 мл-10,0001 мл-112,4±0,511,5±0,332,6±0,7*31,9±1,330,1±1,926,7±1,725,9±2,923,1±0,51,6±0,121,6±0,11,48±0,08Различия между группами с нифедипином (7-я группа) и контролем (4-ягруппа) были статистически недостоверны (табл.15, рис. 12).Таблица 15.
Влияние нифедипина на морфофункциональные показателиперитонеальных макрофагов (M±m)ПоказателиКонтрольНифедипин (конц.)0,00005 мл-10,0001 мл-1МТМ, %60,5±3,161,3±2,756,1±3,4TNF-, пг/мл321,3±21,1297,1±9,8271,2±14,2IL-1, пг/мл54,4±4,255,4±3,147,4±3,9114МИОПКГМТМTNF-αIL-110%0%-10%-20%0,5 мг/мл-30%1,0 мг/мл-40%-50%-60%-70%-80%Рис. 12. Влияние нифедипина на морфофункциональные показателиперитонеальных фибробластов и макрофагов (процент снижения от уровняконтроля).Таким образом, исследование не описанного ранее фармакологическогодействия БМКК на клетки соединительной ткани показало, что верапамил идилтиаземв концентрациях 0,00005 мл-1 и 0,0001 мл-1 оказывали различноенормализирующее влияние на усиленную асептическим воспалением брюшиныпролиферативнуюактивностьиосновнуюсинтезирующуюфункциюфибробластов и макрофагов. Наиболее выраженный модулирующий эффект накультуру клеток оказывал верапамил в концентрации 0,0001 мл-1.
Выявленныефармакологическиефибробластовэффектыреализовалисьверапамилапрямымвотношенииугнетениемперитонеальныхпролиферативнойисинтетической активности последних, а также моделированием функциональнойактивности их микроокружения, прежде всего – клеток системы мононуклеарныхфагоцитов.Вверапамилом,культурахфибробластовимакрофагов,активность митотического процесса,пролиферации Ki-67инкубируемыхсэкспрессии маркерауменьшалась более значимо, чем с дилтиаземом. Синтез115белковосвязанного оксипролина, гиалуроновой кислоты, TNF- и IL-1 в культуреактивированных клеток при действии верапамилатакже был ближе кпоказателям в культуре клеток интактных крыс, чем при действии дилтиазема.Результаты исследований in vitro позволяют утверждать, что присутствие винкубационной среде таких БМКК, как верапамил и дилтиазем, оказываютдозозависимоевлияниенаморфофункциональныехарактеристикиперитонеальных клеток в культуре, течение процессов пролиферации и синтезакомпонентовмежклеточногоматрикса,провоспалительныхцитокинов.Унифедипина эффекта влияния на клетки соединительной ткани (чрезмернуюпролиферативную и синтетическую активность перитонеальных фибробластов имакрофагов) выявить не удалось.
Различия между изученными показателями вкультурах клеток с добавлением нифедипина и без него были статистическинедостоверны.4.3. Оценка влияния классических БМКК верапамила, дилтиазема инифедипина на активность ядерного фактора транскрипции NF-kBОсобое внимание в настоящее время уделяется исследованию процессов,происходящих в клетках на молекулярном уровне и включающих индукциютранскрипционныхфакторов,регулирующихпоследующуюактивациюитранскрипцию специфических генов регенерации.
Нуклеарный (ядерный) факторNF-κB является одним из главных транскрипционных факторов, играющихважнуюрольвклеточнойпролиферации,апоптозе,воспалительнойиаутоиммунной реакциях, поскольку регулирует экспрессию генов, вовлеченных вэти процессы [515]. NF-κB представляет собой комплекс белков семейства Rel,которые в большинстве покоящихся клеток неактивны и находятся в цитоплазмев комплексе со специфическими ингибирующими белками IκB [331].Пристимуляции NF-κB переходит в свободное состояние, перемещаясь в ядро, гдепроявляет активность, связываясь с промоторным участком специфического гена,и запускает процесс транскрипции [76].116Намипроанализированыпоказателиэкспрессиитранскрипционногофактора NF-kB (р50/р65) в первичной культуры перитонеальных фибробластовкрыс и в ядерном экстракте перевиваемой культуры дермальных фибробластов(Human Dermal Fibroblasts (Adult) производства Axol Bioscience, а также влияниеБМКК нифедипина, дилтиазема и верапамила на его активность.
Исследования,проведенныесиспользованиемпервичнойкультурыперитонеальныхфибробластов крыс с гемоперитонеумом и интактных животных (контроль)показали, что количество ядерного фактора транскрипции NF-kB (р50/р65) вобразцах лизата клетокопределяемойконтрольных культур не превышало минимальнойконцентрации(150пг/мл).Вядерныхлизатахкультурактивированных клеток содержание NF-kB было выше в 4,5 раза.97120100**80*ВерапамилДилтиазем6040Нифедипин20НифедипинДилтиазем0Верапамил0,00005 /мл0,0001 /млРисунок 13.
Дозозависимое влияние БМКК на содержание NF-kB (пг/мл) вперитонеальных фибробластах крысы (процент от уровня контроля).* - достоверность отличий от контрольного показателя, р<0,05Активность NF-kB (р50/р65)гемоперитонеумомв культурах, полученных от крыс с(1-я группа) без добавления лекарственных средств винкубационную среду, а также при добавлении в культуры клетокраствора117верапамила (2-я группа), дилтиазема (3-я группа) и нифедипина (4-я группа) быларазличной (табл.16, 17, 18). Введение верапамила в культуру клеток (группа 2)предотвращалочрезмернуюактивациюядерногофакторатранскрипциифибробластов: уровень NF-kB в ядерных лизатах культур снизился приконцентрации верапамила 0,00005 мл-1 на 15,8%, при концентрации 0,0001 мл-1 на28,2% (р<0,01 и 0,001 соответственно, табл.
16, рис.13).Таблица 16. Изменение содержания NF-kB (пг/мл) под влиянием разныхконцентраций верапамила в ядерных экстрактах перитонеальных фибробластовкрысы (M±m).ПоказателиГруппы1-я (безлекарственныхсредствNF-kB (пг/мл)671,7±21,3Примечание:2-я (верапамил, конц.)0,00005 мл-10,0001 мл-1565,1±16,7**482,4±26,5**** - достоверность различий с группой без введениялекарственных средств, * - p<0,05; ** - p<0,01; *** - p<0,001.Добавление дилтиазема (группа 3)в культуру клеток вызывало менеезначимое, в сравнении с верапамилом, уменьшение активированного NF-kB. Егоуровень в 3-й группе был ниже значений 1-ой группы на 15,1% (р<0,01) толькопри концентрации дилтиазема 0,0001 мл-1, при меньшей концентрации препаратапоказатели не отличались от уровня культур без добавления лекарственныхсредств (табл.
17, рис. 13). Сравнительный анализ уровней активированного NFkB во 2-й и 3-й группах выявил достоверное различие показателей (p<0,05).118Таблица 17. Изменение содержания NF-kB (пг/мл) под влиянием разныхконцентраций дилтиазема в ядерных экстрактах перитонеальных фибробластовкрысы (M±m).ПоказателиГруппы1-я (безлекарственныхсредствNF-kB (пг/мл)671,7±21,3Примечание:3-я (дилтиазем, конц.)0,00005 мл-10,0001 мл-1650,5±31,2^570,5±21,8**^* - достоверность различий с группой без введениялекарственных средств, * - p<0,05; ** - p<0,01; *** - p<0,001. ^ - достоверностьразличий между 2-й (верапамил, табл.
16) и 3-й (дилтиазем) группами (p<0,05)Нифедипин практически не оказывал влияния на активность ядерногофактора транскрипции (табл. 18), содержание NF-κB в 1-ой и 4-й группахстатистически не разнилось.Таблица 18. Изменение содержания NF-kB (пг/мл) под влиянием разныхконцентраций нифедипина в ядерных экстрактах перитонеальных фибробластовкрысы (M±m).ПоказателиГруппы1-я (безлекарственныхсредствNF-kB (пг/мл)671,7±21,34-я (нифедипин, конц.)0,00005 мл-10,0001 мл-1677,9±30,3^607,9±32,2^Примечание: ^ - достоверность различий между 2-й (верапамил, табл.16) и4-й (нифедипин) группами (p<0,05)119Оценка транскрипции NF-kB (р50/р65) при стимуляции его активности вкультуре дермальных фибробластов человека путем добавления в культурыклеток TNF-a, а также оценка влияния БМКК на функциональную активностьклеток показала, что при активации ядерного фактора транскрипции NF-kB(р50/р65) TNF-a его уровень повышался в 4,8 раза (721,3±22,6 пг/мл) посравнению с контрольными культурами дермальных фибробластов, в образцахлизата клеток которых содержание NF-kB (р50/р65) не превышало минимальнойопределяемой концентрации (150 пг/мл).
Сравнительный анализ количества NFkB дермальных фибробластов человека выявил статистически значимое снижениеего содержания в культурах активированных клеток при инкубации последних сверапамилом (2-я группа, табл.19).Таблица 19. Изменение содержания NF-kB (пг/мл) под влиянием разныхконцентраций верапамила в ядерных экстрактах культуры Human DermalFibroblasts (Adult), производство Axol BioscienceПоказателиГруппы1-я (без2-я (верапамил, конц.)лекарственныхсредств)NF-kB (пг/мл)721,3±22,6Примечание:0,00005 мл-10,0001 мл-1631,7±16,5*411,4±19,7**** - достоверность различий с группой без введениялекарственных средств, * - p<0,05; ** - p<0,01; *** - p<0,001.Введение верапамила в культуральную среду, предотвращало активациюядерного фактора транскрипции NF-kB останавливая его наработку в течении 24часов инкубации с 0,00005 мл-1 препарата на уровне 87,5% (р<0,05), с 0,0001 мл-1на уровне 57,0% (р<0,001)от показателей в культуре активированныхфибробластов без добавления лекарственных средств (рис.14).
Наличие уверапамила угнетающего влияния на NF-kB дермальных фибробластов объясняет120его антипролиферативное действие в отношении фибробластов в составесоединительнотканных образований различной локализации [523, 361, 512.120100*80Верапамил*60Дилтиазем40Нифедипин20НифедипинДилтиазем0Верапамил0,00005 /мл0,0001 /млРис.14. Дозозависимое влияние БМКК на содержание NF-kB (пг/мл) вкультуре дермальных фибробластов человека (процент от уровня контроля). * достоверность отличий от контрольного показателя, р<0,05Дилтиазем и нефидипин не оказывали существенного действия нанормализацию гиперподукцииактивированного транскрипционного ядерногофактора NF-kB (р50/р65) дермальными фибробластами.Различия между показателяминифедипином соответственно3-й и 4-й групп с дилтиаземомии 1-й группы без лекарственных средств былистатистически недостоверны и резко, как и в 1-й группе, отличались от контрольных неактивированных TNF-a культур.121Таблица 20.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
