Диссертация (1154329), страница 13
Текст из файла (страница 13)
В контроле вводили растворитель. Учет степениреакции происходил визуально через полчаса пoсле введения разрешающейдозы.Кoнъюнктивальная проба проводилась также через 10 дней от окончаниявведения препарата. Для этого препарат в разведении 1:10 закапывался вконъюнктивальный мешок под верхним веком. Для контроля в другой глаззакапывался физраствор. Учет проводился визуально через 15 минут.Для оценки реакции общей анафилаксии через 30 дней от окoнчаниявведения препарата внутрибрюшинно животным вводилась разрешающая дозапрепарата.
Оценку анафилаксии осуществляли в индексе по Weigle [WeigleW.O., 1960]: при гибели всех животных в группе индекс Weigle составляет4(++++). При тяжелом шоке – 3(+++), при умеренном шоке – 2(++), при слабом62шоке – 1(+), при отсутствии анафилактоидных реакций у морских свинок –индекс равен 0.Для oценки реакции непрямoй дегрануляции тучных клетoк через 10 днейот начала введения препарата отбиралась сыворотка крови. Полученнаясыворотка использовалась для проведения эксперимента на тучных клеткахкрыс. Для этого крысам после эвтаназии вводили внутрибрюшинно 6-7 млтеплого раствора Тироле без глюкозы (37 градусов), затем делался массажбрюшной стенки, выполнялся разрез по средней линии, и собирался экссудатэкссудат, стекающий из брюшной полости.
Препараты готовились напредметных стеклах, которые были заранее прокрашены 0,3% р-ромнейтральнoго краснoго. Смешивалась взвесь тучных клеток (30 мкл) ссывороткой морской свинки, и раствора препарата. Далее препараты покрывалипокровнымстекломиинкубировали15мин.при37ºC.Препаратымикроскопировали под увеличением x20. Оценку результатов проводили путемподсчета индекса дегрануляции тучных клеток: ИДТК = (a + 2*b + 3*c + 3*d) /100, где: a, b, c, d - число дегранулирoвавших клетoк с разной степеньюдегрануляции (слабoвыраженной, умереннoй, резкoвыраженной и полностьюдегранулированных клетщк). Если ИДТК превышал 0,2, то реакция считаласьположительной.2.2.4. Патоморфологические исследованияНекропсия включала в себя наружный осмотр, обследование полостей иположения внутренних органов, макроскопическое исследование внутреннихорганов.2.3.
Исследования фармацевтической активности препарата (работа склеточными линиями)2.3.1. Опухолевые клетки63Штаммы опухолевых клеток рака линий рака простаты крысы CRL-2376(MAT-Ly-Lu) и рака простаты человека CRL-1740 (LNCaP) и CRL-1435 (PC-3)получены из коллекции опухолевых штаммов РОНЦ (г.
Москва). Клеточныекультуры транспортировались и хранились при температуре жидкого азота. Длякультивирования клеток CRL-1435 (PC-3) использовалась среда F-12K сфетальной сыворoткой коров 1:10. При культивировании клетoк CRL-2376(MAT-Ly-Lu) и CRL-1740(LNCaP) использовалась среда RPMI-1640 сфетальной сыворoткой коров 1:10. Опухолевые клетки CRL-1622 (KLE) и HTB113 (HEC-1-B) (рак эндометрия человека) предоставлены НИИ oнкологии им.Н.Н.
Петрoва (г. Санкт-Пeтербург). Клеточные культуры транспортировались ихранились при температуре жидкого азота. Для культивирования клеток CRL1622 использована среда DMEM:F12. Для культивирования клеток HTB-113использована среда EMEM с фетальной сыворoткой коров 1:10. Клеткипересевали при достижении конфлюэнтности 80-90%.
Пересеивали 2-3 млн.клеток в новый флакон Т175. Флаконы с клетками хранились в СО2-инкубаторе.Среда во флаконах обновлялась раз в 3 дня.2.3.2. Модель in vitroКлетки рассевали по 96-луночным планшетам для микротитрования вконцентрации 5х105 клеток на мл. При достижения монослоя клеток ростовуюсреду заменяли на среду с исследуемым препаратом DIM (препаратпредварительнорастворяли в водноспиртовом растворе, содержащем 20%этанола, так, чтобы конечная концентрация входящего в его состав 3,3’дииндолилметана находилась в диапазоне 10-100 мкМ), после чего клеткиинкубировали еще в течение 48 час. Проводилось культивирование клеток всехтрех используемых линий.Выживаемость опухолевых клеток после инкубации с препаратомоценивали с помощью МТТ-теста.
За несколько часов до окoнчания инкубациидобавляли раствор 3-[4,5-диметилтиазол-2-ил]2,5-дифенилтетразолия бромид64(МТТ) в среде - по 50 мкл раствора с концентрацией 1 мг/мл. После окoнчанияинкубации среду удаляли, формазан экстрагировали диметилсульфоксидом иопределяли его содержание на спектрофотометре (по поглощению на 540 нм).Долю живых клеток оценивали в % от контроля и рассчитывали среднее истандартное отклонение пяти независимых экспериментов. Величину IC50определяли по графику зависимости остаточной выживаемости клеток (процентживых клеток относительно контроля) от концентрации DIM.
Для этой цели былпроведен регрессионный анализ и получено уравнение экспоненциальнойрегрессии, описывающее экспоненциальную линии тренда путем расчета точекметодом наименьших квадратов. Полученное уравнение использовалось длярасчета IC50.Для исключения влияния цитотоксического воздействия препарата наклеточные линии в аликвотах внеклеточной жидкости определяли степеньнекроза клеток по активности лактатдегидрогеназы (ЛДГ).2.3.3. Модель in vivoВ экспериментах in vivo использовались только клетки рака простатычеловека CRL-1740 (LNCaP) и CRL-1435 (PC-3).
После окончания периодакарантина и разделения на группы животным подкожно перевивали клеткилиний рака простаты. Для этого готовили суспензию клеток в стерильномфосфатном буфере PBS с концентрацией 2,5х107 клеток в мл. Полученнуюсуспензию клеток вводили мышам подкожно вдоль позвоночника (в районелевой лопатки) в объеме 0,2 мл на мышь (5*106 клеток).В исследовании влияния препарата на ксенографты опухолей через 3 дняпослеимплантациираковыхклетокживотныхразделялина4экспериментальных группы, по 30 животных в каждой, и начинали лечениеисследуемым препаратом согласно таблице 1.
Исследуемый препарат Инфеминвводили каждому виду животных внутрижелудочно (в/ж) через атравматичныйметаллический зонд ежедневно в зависимости от веса.65Таблица 1. Эксперимент с ксенографтамиЛиния клетокПрививочная дозаТерапия5x106 клетокрастворитель(n=30)5x106 клетокИнфемин,133 мг/кг (n=30)CRL-1740Объемвведенияпрепарата7.3 мл/кг5x106 клетокрастворитель(n=30)5x106 клетокИнфемин,133 мг/кг (n=30)CRL-1435Поскольку прививочная доза в 5 млн. клеток привела к появлениюопухолей у всех экспериментальных животных, для оценки туморогенности былпроведен отдельный эксперимент. В исследовании влияния препарата натуморогенность клеток опухолей в день имплантации раковых клеток животныхразделяли на 4 экспериментальных группы, по 20 животных в каждой, иначинали лечение исследуемым препаратом согласно таблице 2.
При этомиспользовалась в два раза уменьшенная прививочная доза клеток.Таблица 2. Эксперимент с ксенографтами (оценка туморогенности)Линия клетокПрививочная дозаТерапия2,5x106 клетокрастворитель(n=20)2,5x106 клетокИнфемин,133 мг/кг (n=20)CRL-1740Объемвведенияпрепарата7.3 мл/кг66Линия клетокПрививочная дозаТерапия2,5x106 клетокрастворитель(n=20)2,5x106 клетокИнфемин,133 мг/кг (n=20)CRL-1435ОбъемвведенияпрепаратаЧастоту образования опухолей в опытной и контрольной группахрассчитывали по формуле: 1× 100%, гдеn – общее число животных в группе, а n1 – число животных в группе спальпируемой опухолью.Оценка противоопухолевого действия проводилась на основании: Оценки доли животных, у которых произошла имплантацияопухоли на 7 день после перевивки Оценки продолжительностижизни животных.
При оценкепродолжительности жизни животных последним днем жизнисчиталсяпредыдущийденьпередднемгибели.Процентувеличения продолжительности жизни животных вычислялся поформуле:СПЖ опыт−СПЖ контрольУПЖ=СПЖ контроль×100%В ходе исследования рассчитывали значение торможения ростаопухоли (Т/С):T/C = Vэксп/Vконтр*100%,где Vконтр – среднеарифметическое объема опухоли в контрольнойгруппе,Vэксп – среднеарифметическое объема опухоли в опытной группе.Для определения объема опухоли применяли формулу:Объем = A*B2/2,67где A – максимальный диаметр опухоли, а B – минимальный. Измеренияпроводили с помощью штангенциркуля.2.4. Эпигенетическая и гормональная активность в экспериментах наживотных2.4.1.
Изучение влияния на гистондеацетилазуИсследование проводили на 40 крысах-самцах (по 20 в группе). Опытнаягруппа получала Инфемин в дозе 133 мг/кг (в пересчете на ДИМ) черезвнутрижелудочныйзонд,контрольная–плацебо(рыбийжир).Уэкспериментальных животных после 1 месяца воздействия под анестезиейкетамином (50 мг/кг) и ксилазином (12 мг/кг) удаляли простату, игомогенизировали участок ткани, затем клетки лизировали. Интегральнаяактивность HDAC изучалась колориметрическим методом с помощью набораHDACFluorometricCellularActivityAssayKit(«Biomol»,США)вфлуорометрических 96-луночных планшетах в соответствии с протоколомпроизводителя.
Для этого по 5 мкл лизата размещалось в лунках 96-луночныхпланшетов в трех повторах в буфере для анализа до конечного объема 25 мкл споследующим добавлением 25 мклсубстрата 1X Fluor de Lys, и планшетвстряхивался в течение 20 мин. Затем 50 мкл проявляющего реагента добавлялии встряхивали еще в течение 10 мин. Флуоресценцию измеряли при 460 нм спомощью считывателя Spectra MAX Gemini XS («Molecular Devices», США) сиспользованием длины волны возбуждения 360 нм.2.4.2. Изучение влияния на метилирование генов-онкосупрессоровИсследование проводили на 40 крысах-самках (по 20 в группе) синдуцированным гиперметилированием генов внутримышечной инъекциейсуспензии сульфида никеля Ni3S2 в физрастворе в дозе 10 мг (объем введения –200 мкл).
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
