Диссертация (1151568), страница 6
Текст из файла (страница 6)
На поверхности недифференцированных клеток лимбаимеются высочайшие уровни рецепторов эпителиального фактора роста,которыеобладаютспособностьюингибироватьдифференцировкуиподдерживать пролиферативный потенциал. Можно предположить, чтолимбальный эпителий имеет в своем составе не только стволовые клетки, нои временно амплифицирующиеся клетки, которые имеют некоторыехарактеристикистволовых.Также,этиклеткиможновстретитьвцентральной части роговицы, но там они обладают меньшим митотическимпотенциалом. Они играют важную роль в регенерации роговицы за счетувеличенной пролиферативной способности[6].27СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯМатериал и методы исследованияОбъектом исследования являлись 55 кроликов (110 глаз) породы Серыйвеликан, массой 2,5 – 3,0 кг, в возрасте от 8 до 10 месяцев, подобранных попринципу аналогов.Животныхпредварительнокарантинироваливтечение7дней,проводили ежедневный клинический осмотр.Использоваликомплексныйметодическийподход,включающийэкспериментальное моделирование повреждения роговицы, офтальмическоеобследованиезоныповреждения,гематологические,морфологическиеметоды исследования и статистический анализ полученных цифровыхданных.Взятие биопсии лимба роговицы и моделирование ее поврежденияпроводили под комбинированной общей анестезией, которая включала в себявнутривенную индукцию животных препаратом пропофол в дозировке 10 мгна кг с дальнейшим переходом на ингаляционную анестезию фораном вдозировке 1 мл на кг в час.Для проведения исследований было сформированно по принципуаналогов 5 групп животных.
Каждой группе соответствовало тестированиеопределенного типа клеток.Первой группе животных вводили аллогенные стволовые клетки лимба;Второй группе животных - аллогенные мезенхимальные стволовыеклетки жировой ткани;Третьей группе животных – аутологичную стромально-васкулярнуюфракцию.За 14 дней до проведения эксперимента у животных групп второй итретьей групп, под общей анестезией производили биопсию жировой и28лимбальной ткани для последующего выращивания стволовых клеток напитательных средах.После получения донорского материала, его транспортировали влабораторию Центра ветеринарной клеточной медицины, где сотрудникилабораториипроизводилидальнейшиеэтапыподготовкиклеточногоматериала по методике «StemCell Technology» (США).Жировую ткань измельчали скальпелем, инкубировали в течение 30 минв растворе коллагеназы при 37°С, инактивировали фермент добавлениемсреды с сывороткой, пропускали через клеточный фильтр с диаметром пор100 нм и дважды отмывали центрифугированием.
Клеточный осадокресуспендировали в среде, высевали на культуральные флаконы и помещалив СО2-инкубатор. Через сутки отмывали от клеточного дебриса и заменялисреду на новую.Клеточные культуры выращивали на среде MesenCult с добавлением 2мM L-глутамина (StemCell Technology, США), 100 ед/мл пенициллина и 100мг/мл стрептомицина (StemCell Technology, США) и 10% добавки длякультивирования клеток MesenCult (StemCell Technology, США).При достижении 70–80% монослоя клеток в первичной культуре ММСКпересевали, используя 0,02% раствор трипсина с 0,05% ЭДТА (StemCellTechnology, США). Плотность посадки клеток составляла 3000–5000 кл/см2.Среду во флаконах с культивируемыми клетками меняли 1 раз в каждые 3–4дня. Клетки культивировали при 37°С в атмосфере 5% СО2.
[6]Так же, было проведено взятие биоптата лимба в транспортную среду,содержащуюантибиотикиантимикотик,еетранспортироваливлабораторию, подвергали ферментативной обработке в стерильных условияхи культивировали на специальных средах, способствующих экспансиистволовых клеток. Культуральную среду меняли раз в 3-4 дня, и придостижении культурой 60-70% конфлюэнтности производили пассирование.Для терапии применяли клетки до 3 пассажа.29У животных, которым планировали вводить стромально-васкулярнуюфракцию, перед экспериментом под местной анестезией производили взятиебиоптата жировой ткани под местной анестезией, который доставляли влабораторию в транспортной среде.
Полученные после липосакции образцыЖТ подвергали ферментативной обработке коллагеназой. Из суспензииотдельных клеток путем центрифугирования выделяли осадочную фракциюклеток стромально-васкулярного фенотипа, состоящую в основном из CD34+клеток с примесью CD45+ лейкоцитарных клеток и эритроцитов.Четвертойгруппеживотных(контрольнаягруппа)вводилифизиологический раствор (Sol. Natrii Chloridi 0,9%).Пятая группа животных была интактной.Перед трансплантацией на базе лаборатории центра ветеринарнойклточноймедицинысуспензиюклетоктщательноотмывалиоткультуральной среды, подсчитывали количество жизнеспособных клеток исуспензировали в минимальном количестве физиологического раствора идоставляли в операционную в течение 2 часов.Увсехживотныхпроводиликератоэктомиюподконтролемоперационного микроскопа фирмы Opton с коаксиальным и боковымосвещением. Увеличение на разных этапах операции варьировало от 6 до 14.Для иссечения роговицы применяли трепаны диаметром 6,5мм, с дозируемойглубиной режущей кромки и шагом в 200 микрон.
Для расслаивания тканейроговицы использовали округлые микролезвия. Основные моменты операциипослойной кератоэктомии осуществляли по общепринятой методике,описанной Дроновым М.М. (2002) [18].На центральную зону роговицы устанавливали трепан диаметром 6,5 ммс ограничением трепанации до 200 мкм. Роговичным расслаивателемпроводили переднюю кератоэктомию в пределах трепанационной зоны.Использованное лезвие обеспечивало гладкое расслаивание роговицы безобразования неровностей, что немаловажно для чистоты эксперимента. В30подопытныхгруппахпроизводилисуспензии стволовых клеток всубконъюнктивальнуюмл0,2физиологическогоинъекциюраствора.Уконтрольных животных в аналогичные сегменты роговицы вводили то жеколичество физиологического раствора (Натрия Хлорид 0,9 %) длявозникновения ответной реакции тканей на введение.В послеоперационном периоде животные находились в защитныхворотниках. Им проводили инстилляции глазных капель с антисептиком 4раза в день для снятия возможных инфекционных осложнений, другиепрепараты не назначали вследствие необходимости обеспечения чистотыэксперимента.Клинические методы исследования включали осмотр переднего отрезкаглаз с помощью фокального и бокового освещения и биомикроскопиющелевойлампойфирмыс«Shin»флюоресцеиновойпробойифоторегистрацией.
Динамическую оценку состояния глаз проводили на 3, 7 и14суткипосле трансплантации повыраженностивоспалительнойинтенсивностипомутненияследующимреакции,диаметруроговицы.признакам:дефектаСтепеньстепениэпителия,выраженностивоспалительной реакции оценивали по балльной системе Ченцовой Е.В. [23].Площадь дефекта стромы роговицы определяли с помощью биомикроскопии.Для иопредеения диаметра поврежденной области роговицы использовалироговичный циркуль по Кастровьехо.
Интенсивность помутнения роговицыоценивали по шкале Войно–Ясенецкого[6].На 15 день исследования животным была проведена энуклеация глазныхяблок с целью выявления морфофункциональных изменений в роговицепосле трансплантации стволовых клеток.Содержание, уход и эвтаназию животных осуществляли согласнотребованиям приказов МЗ СССР №755 от 12.08.1977, №701 от 27.07.1978,«Санитарныхправилпоустройству,экспериментально-биологическихоборудованиюклиник(вивариев)»,исодержанию«Европейской31конвенциипозащитепозвоночныхживотных,используемыхдляэкспериментальных и других научных целей» (1986) и «Хельсинскойдекларации всемирной медицинской ассоциации» (1964).Для проведения гистологических исследований материал фиксировали врастворе 10% нейтрального формалина, промывали, затем обезвоживали вспиртах восходящей концентрации по общепринятой методике.
Срезыготовили на ротационном амортизированном микротоме НМ-325 (MicrotomInternational GmbH, Germany) и окрашивали гематоксилином и эозином, атакже толуидиновым синим для выявления общей морфологическойкартины. Изучение гистологических срезов и микрофотосъемку проводилипри помощи светового микроскопа Jenamed-2 (Carl Zeiss, Jena, Germany),совмещенного с системой цифровой микроскопии ImagScope C (ООО«Системы для микроскопии и анализа»).Микроскопическуюсертифицированноймикроскопиииморфометриюпрограммыанализа»),выполнялиImagScopeсовмещеннойCс(ОООспомощью«СистемымикроскопомдляJenamed-2.Определяли суммарную толщину роговицы в лимбальной и центральнойзонах, а так же отдельно толщину всех слоев роговицы.Статистическую обработку морфометрических данных осуществляли спомощью программы ImagScope C (ООО «Системы для микроскопии ианализа»). Оценку статистической значимости различий исследуемыхпоказателей осуществляли с использованием критерия Стьюдента.32РЕЗУЛЬТАТЫ СОБСТВЕННЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХОБСУЖДЕНИЕМорфологические и морфометрические характеристики роговицыглазного яблока кролика в контролеПри визуальном исследовании состояния глаза кролика в нормеустановлено, что роговица имеет сферическую форму, она прозрачная,гладкая, блестящая, лишена кровеносных сосудов, покрыта слёзной плёнкой.Рис.
1. Внешний вид роговицыкролика. Контроль. Роговицасферической формы, прозрачная,гладкая, блестящая.Микроструктура роговицы у контрольных животных соответствуетобщим закономерностям организации этой части глазного яблока.Центральная часть дифференцирована на:наружныйэпителиальныйпласт,представленныймногослойнымплоским неорговевающим эпителием, состоящим из 5-7 слоёв клеток;33боуменову мембрану, в структуре которой находится слой уплотнённыхпучков коллагеновых волокон;собственноевещество,образованноеаваскулярнойплотнойоформленной соединительной тканью с выраженными межволоконнымипространствами;десцеметову мембрану, сформированная плотно упакованными пучкамиколлагеновых волокон;внутреннийэпителиальныйпласт,представленныйоднослойнымэпителием, сформированным клетками полигональной формы.123А54341234Б5Рис.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
