Диссертация (1151316), страница 18
Текст из файла (страница 18)
К 0,5 мл гомогената ткани добавляют3,5 мл дистиллированной воды и тщательно перемешивают. Реакциязапускается добавлением к 1 мл разведенного гомогената 2,0 мл раствораокисленного глутатиона. По 1,0 мл смеси переносят в две центрифужныепробирки (опытная и контрольная пробы), помещают их в водяную баню при37°С и инкубируют в течение 5 мин. В опытную пробу добавляют 0,1 млраствора 5,35 мМ NADPH, интенсивно встряхивают и оставляют в водянойбане.
Через 10 мин в опытную и контрольную пробу добавляют по 1 млохлажденного раствора 10% ТХУ. После этого в контрольную пробудобавляют 0,1 мл раствора 5,35 мМ NADPH. Обе пробы встряхивают ивыдерживают 10 мин на холоду, после чего их центрифугируют в течение 15мин при 3000 об/мин. К 1 мл надосадочной жидкости контрольной и опытнойпроб приливают по 5 мл фосфатного буфера (рН 8,0) и 0,05 мл реактиваЭллмана (39,6 мг 5,5-дитио-бис-(2-нитро-бензойной) кислоты растворяют в10 мл абсолютного метилового спирта) и тщательно перемешивают.104Изменение оптической плотности в опытной пробе (по сравнению сконтрольной пробой) регистрируют в кювете с толщиной поглощающегослоя 10 мм при 412 нм.
Активность глутатионредуктазы рассчитывают поформуле:,(2.8)где А – активность фермента, М.Е.(мкМ окисленного глутатиона /мг×мин);6,05 – конечный объем пробы;106 – коэффициент пересчета, мкМ;84 – фактор разведения гомогенатата;10 – время инкубации, мин;2 – коэффициент пересчета на окисленный глутатион;13,1×103 – коэффициент молярной экстинкции окрашенного аниона,образующегося при взаимодействии G-SH с ДТНБК.Метод определения активности глутатион-S-трансферазыАктивностьглутатион-S-трансферазыопределяютпоскоростиобразования глутатион-S-конъюгатов между восстановленным глутатионом(G-SH) и 1-хлор-2,4-динитробензолом (CDNB) [519].При проведении исследования готовят реакционную смесь, котораясодержит 2,5 мл 0,1 М натрий фосфатного буфера (pH 6,5), 0,2 мл 0,015 MCDNB, 0,015 М раствора G-SH и 0,1 мл супернатанта. Реакцию инициируютвнесением в кювету 0,2 мл 0,015 М CDNB.
Параллельно опытной пробеготовят контрольную пробу, в которую вносят все выше перечисленныереагенты, кроме CDNB. Активность глутатион-S-трансферазы регистрируютчерез 3 минуты по увеличению концентрации глутатион-S-конъюгатовспектрофотометрически при длине волны 340 нм (максимум поглощенияглутатион-S-CDNB) при температуре 25°C. Активность фермента в плазмерассчитывают по формуле:105,(2.9)где А – активность фермента , мМоль/(мин × мг белка);E – изменение оптической плотности;t – время измерения, мин;– молярный коэффициент погашения комплекса GSH-CDNB,который составляет 9600103 – коэффициент для пересчета активности фермента из Моль вмМоль;V1 – общий объем реакционной смеси, мл;V2 – объем вносимой пробы, мл.2.2.1.5 Цитологические методы исследованияВ цельной крови с помощью автоматического гематологическогоанализатора "PCE-90 VET" (США) определяли количество лейкоцитов, атакже общее количество гранулоцитов и отдельно моноцитов и лимфоцитов.Лейкоцитарную формулу дополнительно исследовали методом подсчетаразличных форм лейкоцитов в мазках крови, окрашенных гематоксилином иэозином по Романовскому-Гимза.
Фагоцитарную активность лейкоцитов(ФАЛ), фагоцитарное число (ФЧ) и индекс завершенности фагоцитоза (ИЗФ)определяли по степени поглощения микробных клеток тест-культурыStaphylococcus aureus [520]. Функциональную активность нейтрофиловоценивали с помощью теста, основанного на восстановлении нитросинеготетразолия(НСТ-тест)[521].Бактерицидную(бактериостатическую)активность сыворотки крови определяли по методике О.В. Смирновой и Т.А.Кузьминой[520],Бактерицидную(бактериостатическую)активностьмолозива определяли по методике Шахова А.Г.
и соавт. [520]. Активностьлизоцима в сыворотке крови определяли по степени лизиса бактерий тесткультуры Micrococcus lisodeicticus [520].1062.2.1.6 Методы статистической обработки данныхРезультатыисследованийобрабатывалипопараметрическиминепараметрическим статистическим критериям для малых выборок [522,523].Метод косвенных разниц (t–критерий Стьюдента) применяли для проверкигипотезы о достоверности разницы между средними. Необходимыми идостаточными условиями использования t–критерия является нормальностьраспределения совокупностей и отсутствие разницы между генеральнымидисперсиями.Гипотезу о нормальности распределения проверяли с привлечениемкритерия хі–квадрат (χ2–распределения) о равенстве генеральных дисперсий(F–критерий Фишера и G – критерий Кохрена).
Гипотезу о грубых ошибкахпроверяли с помощью правила "трех сигм" и критерия Шовене. Приотклонении элементов выборки от нормального, для установления разницымежду двумя средними, применялись непараметрические критерии (U–критерий Уилкоксона–Манна–Уитни). Результаты, приведенные в таблицахи гистограммах, имеют вид средней ± стандартная ошибка средней (M ± m) .Расчеты проводились с помощью IBM-совместимого компьютера попрограммам "Statistica 6.0" и "Excel 2000".
Показатели считали достовернымипри P<0,05.1072.3 РЕЗУЛЬТАТЫ СОБСТВЕННЫХ ИССЛЕДОВАНИЙНегативнымпоследствиеминтенсивногоразвитиясовременныхтехнологий является неуклонное расширение спектра токсичных веществтехногенного происхождения. При всем многообразии таких поллютантовионыметалловипромышленныеорганическиексенобиотикирассматриваются как наиболее опасные факторы риска, обусловливающиеантропогенный прессинг в ходе трансформации экосистем.2.3.1 Использование показателей оксидативного стресса в качествеиндикатора повреждений в условиях воздействия промышленныхполлютантовВусловияхтехногенногозагрязнениягидросферыисследованиезакономерностей токсического воздействия промышленных поллютантов наорганизм животных разных таксонов является наиболее актуальным.Интенсивностьвоздействиянабиоэнергетическиепроцессы,антиоксидантную, пищеварительную и нервную систему животных вомногом зависит не только от количества, но и от различных сочетанийтипичных в современном мире загрязнителей – ионов металлов иорганических ксенобиотиков.Такие изменения в тканях животных,обитающих в условиях загрязнения окружающей среды, могут бытьиспользованы как для выявления нарушений на ранних стадиях патологии,так и при мониторинге состояния популяций различных биологическихвидов.Наиболеераспространеннымметаболическимнарушением,возникающим в клетках под действием неблагоприятных факторов, являетсяоксидативныйстресс–одинизглавныхиндукторовструктурно-функциональных изменений организма.
В зависимости от интенсивностивоздействия, оксидативный стресс может быть как локальным, умеренным,108так и сильным, приводящим не только к структурно-функциональнымнарушениям, но и к гибели клеток.2.3.1.1 Влияние ионов кадмия на развитие оксидативногостресса в головном мозге крыс в экспериментальных моделяхРезультатыисследованийдаютоснованияутверждать,чтомеханизмы токсических эффектов промышленных поллютантов тесносвязанысизменениемокислительно-восстановительногобалансаиувеличением количества оксидативных повреждений клеток.
Наличиеоксидативногостресса–одногоизцентральныхмеханизмовнейротоксичности, подтверждают данные о содержании конечных продуктовперекисного окисления липидов в различных отделах головного мозга крыс(гиппокамп, мозжечок, кора больших полушарий), получавших хлоридкадмия с питьевой водой.Во всех исследованных отделах особей экспериментальных группживотных обнаружено достоверное однотипное повышение (по сравнению сконтролем) содержания ТБК-активных продуктов на 28-70-ые суткипостнатального развития. Рост синтеза продуктов ПОЛ в гиппокампеживотных экспериментальных групп относительно особей контрольныхгрупп этого же возраста составил в среднем 102% (СПР-28, Р<0,01), 72%(СПР-42, Р<0,01), 46% (СПР-56, Р<0,05) и 47% (СПР-70, Р<0,05).
Динамикапоказателей оксидативного стресса в головном мозге крыс в процессепостнатального развития при интоксикации кадмием представлена нарис. 2.10.Выявленные различия свидетельствует об устойчивом нарушениинормальногометаболизмаклетокнервнойтканиживотных.Изисследованных фаз постнатального развития наиболее чувствительным кдействию токсикантов является период непосредственно после рождения.Наиболее вероятно, что это связано с особенностями постнатальногоразвития ЦНС грызунов, у которых в первые 2-3 недели жизни происходит109завершениемиграциинервныхклетокиформированиезрелыхморфологических образований мозга.
Такой процесс требует существенныхэнергетических затрат, ассоциирован с высокой функциональной нагрузкоймитохондрий и, соответственно, значительной степенью риска генерацииСодержание ТБК-активных продуктов(нМ/мг ткани)оксидативного стресса при действии повреждающих токсичных факторов.10**9***8*76543210К CdСПР-28К CdСПР-42К CdСПР-56К CdСПР-70Рис. 2.10 Содержание конечных продуктов ПОЛ в головном мозге крыс на 28, 42, 56,70 сутки постнатального развития (СПР) в условиях воздействия хлорида кадмия (Cd) посравнению с контролем (К); * – P<0,05; ** – P<0,01 – достоверность разницы в сравнениис контролемРезультаты проведенных исследований позволяют утверждать, что ионыCd2+ имеют выраженный стимулирующий эффект на развитие оксидативногостресса в мозге крыс в процессе постнатального онтогенеза. Интоксикациямалыми дозами хлорида кадмия приводит к достоверному росту содержанияпродуктов деструкции липидов в различных отделах головного мозга крыс(коре больших полушарий, гипокампе и мозжечке) на всех исследуемыхстадияхразвития.Такоеизменениеокислительно-восстановительногобаланса особенно в раннем возрасте животных может быть основнойпричиной отсроченных патогенетических событий, увеличивающих рискнейродегенеративных нарушений.1102.3.1.2 Влияние ионов свинца на развитие оксидативногостресса в головном мозге крыс в экспериментальных моделяхСоединения свинца относят к наиболее опасным загрязнителям,количество которых в окружающей среде неуклонно увеличивается ввидуширокогокругаисточниковпоступления(выбросыпромышленныхпредприятий, выхлопные газы автотранспорта, сжигание угля и т.п.) [524].Постоянное присутствие свинца в воздухе, питьевой воде и продуктахпитания в количествах, приближающихся к подпороговым, обусловливаетнеобходимость исследования особенностей молекулярных механизмовпатологического влияния низких доз Pb2+ на ЦНС в период развития.Принимая во внимание, что процессы раннего онтогенеза сопровождаютсяактивной пролиферацией и дифференциацией определенных субпопуляцийклеток ЦНС, которые чрезвычайно чувствительны к действию токсичныхфакторов, понимание ответных молекулярных и клеточных реакций можетявляться важным звеном в изучении механизмов развития патологий ЦНС истратегии нейропротекции.
Наиболее вероятно, что механизмы токсическихэффектов ионов свинца в ранней постнатальной фазе развития связаны снарушением окислительно-восстановительного баланса и увеличениемуровня оксидативных повреждений клеток.При моделировании интоксикации животных ацетатом свинца выявленохарактерное возрастание содержания продуктов ПОЛ в головном мозгеособей всех экспериментальных групп, что свидетельствует об однотипнойреакции тканей на повышенные концентрации органических поллютантов(рис.2.11).Результатыисследованиявозрастныхизмененийокислительно-восстановительного баланса в головном мозге крыс при интоксикациисвинцомуказываютнаразличнуюинтенсивностьоксидативныхповреждений у животных в разные фазы постнатального развития.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
