Диссертация (1151316), страница 17
Текст из файла (страница 17)
Пероксидазную активность проявляли по модифицированномуметоду Грэхема и Kaрновски [510, 511]. Реакционная смесь (готовитсянепосредственно перед использованием): 50 мM трис-HCl буфер (рН 7,4),0,05% пероксида водорода и 0,05% тетрагидрохлорид диаминобензидин.Каплю раствора наносили на срез. При комнатной температуре окраскаразвивается в течение 5 мин. Снимки срезов делали с использованиеммикроскопа ЛЮМАМ-И2 для увеличения (×200).2.2.1.3 Метод определения ТБК-активных продуктов перекисногоокисления липидовПроцесс избыточного перекисного окисления липидов (ПОЛ) являетсяважной причиной клеточных дефектов.
Длительная активация ПОЛ приводитк накоплению конечных токсических продуктов (свободных радикаловжирных кислот, липоперекисей, альдегидов, кетонов, оксикислот и др.).Окислительная деградация липидов, которая происходит, главным образом,под действием свободных радикалов, является наиболее информативнымпоказателем окислительного стресса в тканях мозга. В настоящее времясуществует ряд методов определения интенсивности образования ПОЛ,большинство из которых позволяет получить достоверные результаты приисследовании систем in vitro, однако приводит к ошибкам при изучениибиологических систем in vivo [512].98Малоновый диальдегид (МДА) – главный продукт перекисногоокисления липидов.
Прирост малонового диальдегида отражает скоростьперекисного окисления тканевых липидов. Однако МДА имеет настолькореакционноспособные метиленовые группы, что не может быть выделен всвободном состоянии, поэтому количественно ПОЛ принято определять посодержанию МДА, реагирующего с тиобарбитуровой кислотой (ТБК), скоторой он образует окрашенный комплекс.
Интенсивность оптическойплотности (или флюоресценции) таких растворов прямо пропорциональнаконцентрации МДА.Содержание ТБК-реактивных соединений определяли в гомогенатахтканей животных для характеристики свободного, NADPH-зависимого иFe2+-зависимого разновидностей ПОЛ [513]. Биологический материалгомогенизировали на холоду в 25 мМ трис-HCl буфере (рН 7,4) ссоотношением ткани и буфера 1:20.
Реакционную смесь для определенияконечных продуктов ПОЛ готовили согласно схеме, представленной нарисунке 2.9.После проведения инкубации в течение 20 мин (t=380С), длядальнейшего осаждения белков, ко всем гомогенатам добавляли 1 мл 20%раствора трихлорацетата и направляли на центрифугирование (10 мин при3000 об/мин). К 1 мл полученного супернатанта добавляли по 1 млдистиллированной воды и 1 мл 0,9% раствора ТБК и кипятили в течение 20мин.
Пробы охлаждали до комнатной температуры и направляли нафотоколориметрирование (λ=532 нм). Контрольная проба содержала всекомпоненты соответствующей реакционной смеси (кроме гомогената тканей)и проходила все этапы инкубации, что и опытные образцы.99Ткань + буфер (1:20)измельчениеГомогенат (2 мл)+0,1 мл 0,5 мкМ NADPH0,1 мл 2 мкМ АDP0,1 мл 4 мкМFe(NH4)2(SO4)2 х 6H2O(соль Мора)Свободное ПОЛ(∑ объем 2 мл)NADPH-зависимое ПОЛ(∑ объем=2,3 мл)+0,1 мл 0,5 мкМаскорбата0,1 мл 4 мкМ NADPHFe2+-зависимое ПОЛ(∑ объем=2,2 мл)Рис.
2.9 Схема приготовления реакционной смеси для определения спонтанного ииндуцированного разновидностей ПОЛ по содержанию ТБК-реактивных соединений вгомогенатах тканей животныхРасчет количества конечных продуктов ПОЛ в 2 мл гомогенатапроводили по формуле (2.4):CЕиссл V1 V2,E532 V3 l(2.4)где С – содержание ТБК-реактивных соединений, нМ;Еиссл – оптическая плотность исследуемой пробы;V1 – объем пробы, направленной на фотоколориметрирование, мл;V2 – объем пробы, направленной на центрифугирование, мл;V3 – объем пробы, направленной на качественную реакциюопределения МДА, мл;Е532 – удельная оптическая плотность МДА (1,56l – длина оптического пути, см.M);cм мл1002.2.1.4 Методы определения активности ферментовМетод определения активности каталазыДля определения активности каталазы использовали модифицированныйколориметрический метод М.А.
Королюка, который основан на способностипероксида водорода образовывать с парамолибдатом аммония окрашенныйкомплекс [514, 515]. Парамолибдат (NH4)6Mo7О24×4Н2О растворенный вH2SО4 ) образует с Н2О2 комплекс пероксомолибдата, имеющий максимумпоглощения при 410:(NH4)6Mo7O24×4Н2О+ H2SO4 → (NH4)2SO4×12MoO3×6 Н2ОMoO3 + Н2О2 → MoO8 (MoO6, MoO5)Перекись разрушающая ферментативная активность рассчитывалась поуменьшению активности окраски пероксомолибдата, с последующимрасчетомконечнойконцентрацииН2О2вреакционнойсмесипологарифмической и линейной калибровочным кривым с использованиемматематических уравнений калибровочных графиков:D = 4,3449 + 3,0597lgC(H2O2) – логарифмическая зависимостьD = -0,3412 +16,0866 × C(H2O2) – линейная зависимостьВходепроведенияисследованийнавескутканимассой2ггомогенизируют с 10 мл охлажденного 50 мМ трис-HCl буфера (рН 7,0) 0,9%NaCl.
Полученный гомогенат направляется на центрифугирование при12000 g 20 мин при 40С. В опытной пробе к 0,1 мл полученного супернатантадобавляли 0,9 мл 50 мМ трис-HCl буфера (рН 7,0) и 1 мл 0,1% Н2О2. Вконтрольную пробу супернатант не добавляют. Пробы оставляют дляпротекания реакции на 1 мин при комнатной температуре.
По окончанииинкубационного периода в опытную пробу вносят 1 мл 4% парамолибдата101аммония на 10% Н2SО4. В контрольную пробу вносят 0,1 мл супернатанта и 1мл 4% парамолибдата аммония на 10% Н2SО4. Для получения холостойпробы к 2 мл 50 мМ трис-HCl буфера (рН 7,0) добавляли 1 мл 4%парамолибдата аммония на 10% Н2SО4.Оптическую плотность измеряли при 405 нм против холостой пробы.Ферментативную активность выражали в нмоль субстрата (Н2О2),трансформированного за 1 минуту инкубации на 1 мг белка:A=,(2.5)где C(pd) – концентрация перекиси, мМ;t – время инкубации, мин;С(р) – концентрация белка, мг/мл;V – объем пробы, мл.Метод определения активности супероксиддисмутазыНепрямойспектрофотометрическийметодоснованнареакциисупероксид-зависимого окисления кверцетина (флавоноид растительногопроисхождения),протекающейвщелочнойсреде,вприсутствиитетраметилэтилендиамина [516].
Реакция сопровождается обесцвечиваниемрабочего раствора. Изменение оптической плотности регистрируют придлине волны 406 нм. Фермент супероксиддисмутаза ингибирует окислениекверцетина за счет нейтрализации супероксид радикалов.При инкубации в течение 20 мин степень ингибирования зависит отконцентрации СОД. Для приготовления раствора флаваноида 1,5 мгкверцетина выдерживают до полного растворения в течение 10 мин в 10 млдиметилсульфоксида (ДМСО).При проведении исследования навеску ткани массой 1 г гомогенизируютв 9 мл 0,9% NaCl.
К полученному гомогенату добавляют дистиллированнуюводу в соотношении 1:399 (общее разведение 4000) – для печени и 1:99102(общее разведение 1000) – для мозга и других тканей. Определение проводятпри нормальных условиях. В каждую пробирку с контрольной пробой вносят3,0 мл фосфатного буфера (рН 7,8), содержащего 0,08 ммоль/л ЭДТА; 0,1 мланализируемого материала и 0,1 мл раствора кверцетина. Для опытных пробанализируемый материал заменяют буферным раствором.Первое определение оптической плотности при 406 нм проводят вкюветах с длиной оптического пути 1,0 см, относительно контроля –фосфатного буфера, немедленно после добавления раствора кверцетина (Do).После инкубации в течение 20 мин проводится повторное определениеоптической плотности при 406 нм (D20).
Изменение оптической плотностираствора кверцетина в контрольной ( D'406) и опытных ( D406) пробахрассчитывают по формуле:D406 ( D'406) = D0 - D20(2.6)Затем определяют процент ингибирования реакции аутоокислениякверцетина в опытных пробах:% ингибирования =× 100(2.7)Содержание фермента в биологическом материале рассчитывается спомощью уравнения, полученного на основании калибровочного графика,который построен с использованием эталонной СОД (Sigma США):y = 0,00000115x4 + 0,00012125x3 + 0,00390790x2 + 0,07661008xгде у – содержание СОД в реакционной смеси;х – процент ингибирования реакции аутоокисления кверцетина вопытных пробах.Опытные значения содержания СОД в исследуемых пробах получаютпри умножении коэффициента, учитывающего разведение анализируемого103материала.
Для мозга (разведение в 1000) – 31, для печени (разведение в4000) – 124. Полученные результаты выражают в единицах активностифермента на миллиграмм исследуемой ткани (или белка).Метод определения активности глутатионредуктазыГлутатионредуктазакатализируетвосстановлениеокисленногоглутатиона, используя в качестве восстановительного эквивалента NADPH(G-S-S-G→G-SH).восстановленногоПринципглутатионаметодаG-SHосновансДТНБКнавзаимодействии(5,5’-дитио-бис-2-нитробензойной кислотой) с образованием окрашенного в желтый цветаниона 2-нитро-5-тиобензоата. Увеличение концентрации аниона 2-нитро-5тиобензоата в ходе данной реакции регистрировали спектрофотометрическипри длине волны 412 нм [517, 518].Дляполучениябиологическогоматериаланавескутканигомогенизируют с охлажденным 50 мМ трис-HCl буфером (рН 7,0) присоотношении ткани и буфера 1:10.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
