Диссертация (1151316), страница 15
Текст из файла (страница 15)
Применение двух методов дляопределения количества белка в пробе дает возможность получить болееточныерезультаты.Полученныеданныеобрабатывалиметодамидисперсионного анализа с использованием F-критерия Фишера. Каждоеизмерение проб и калибровочных образцов проводили трижды, для расчетовиспользовали среднее арифметическое значение содержания белка.Метод ЛоуриСодержание общего белка в экстрактах определяли методом Лоури вмодификации Миллера [496].
Данный метод основан на биуретовой реакции(реакции на пептидные связи) и реакции Фолина (реакции на остаткитирозина и триптофана). Метод позволяет получить воспроизводимыерезультаты и является достаточно чувствительным (~ 0,2 мкг белка). Однакок его основным недостаткам относится достаточно медленное развитиеокраски (в течение 40-50 мин). В диапазоне концентраций от 15 до 40 мкгили 30-80 мкг (при увеличении вдвое объемов реагентов) зависимостьпоглощения раствора количества белка линейная.
В качестве стандартаиспользовали раствор, концентрация БСА в котором составляла 1 мг/мл. Приопределениисодержаниябелкавофракцияхрастворенныхисолюбилизованих мочевиной и тритоном-Х100 калибровочные графикистроили с добавлением к раствору БСА соответствующего буфера. Расчетыпроводились в диапазоне 30-80 мкг, в котором оптическая плотность имеетлинейную зависимость от концентрации белка. Оптическую плотность86измеряли на фотоэлектроколориметре КФК-2-УХЛ4.2 при длине волны 750нм. Содержание белка во фракциях мозга определяли по формуле:CX R,0,4(2.1)где С – концентрация белка в гомогенатах ткани мозга, мкг/мл;Х – количество белка в разведенных образцах, полученное покалибровочному графику, мкг;R – степень разведения гомогенатов ткани мозга.Метод БредфордМетод характеризуется достаточно высокой чувствительностью (~0,2мкг белка), относительной скоростью проведения и воспроизводимостьюрезультатов.
Этот метод позволяет определять содержание белка в растворахс точностью от 0,5 до 50 мкг/мл и может быть применен к пробам, в которыхбелки,раствореннывэлектрофоретическомбуфере,содержащемдодецилсульфат натрия (ДСН), меркаптоэтанол или трис-буфер.Метод основан на образовании окрашенных комплексов кумасибриллиантового голубого G-250 с полипептидами, которое происходит засчет электростатических взаимодействий. Максимум поглощения такихкомплексов в видимой области спектра не совпадает с максимумомпоглощения чистого красителя, что позволяет осуществить количественноеизмерение образующихся комплексов [497].
Содержание белка во фракцияхмозга определяли по формуле:CX R,0,1где С – концентрация белка в гомогенатах ткани мозга, мкг/мл;Х – количество белка в разведенных образцах, полученное покалибровочному графику, мкг;R – степень разведения гомогенатов тканей.(2.2)87Методы выявления и идентификации белковДиск-электрофорез, как метод разделения макромолекул белков, былпредложен Л. Орнштейном в 1964 [498]. С помощью этого метода белкираспределяются как по общему электрическому заряду, так и помолекулярной массе и форме.
В электрическом поле белковые зонымигрируют сквозь поры геля до некоторого конечного положения, котороеобусловлено сопротивлением среды. Расстояние, пройденное белками,связано с их молекулярной массой, которую можно определить путемсравнения с поведением белков-маркеров. Использование двухслойногоносителя с различным размером пор и двух буферов, которые отличаютсямежду собой по составу и значению рН, приводит к концентрации веществ вузкой стартовой зоне и обеспечивает распределение компонентов смеси [499,500].Метод электрофореза в полиакриламидном геле (ПААГ)Электрофорез проводили по стандартной методике Лэммли (Laemmli,1970) в пластине ПААГ толщиной 1 мм [501].
В геле, для разделения белков,формировали градиент акриламида (Т =7-18%). Состав разделяющего геля:Т=7-18%, С = 0,8-2,5 %; 0,375 М трис-HCl буфер (рН 8,8); 0,1% ДСН; 0,025 %тетраметилендиамина (ТЕМЕД ); 0,025 % персульфата аммония (ПСА). Дляпредотвращениянеравномерногонабуханиягеляиприданияемуэластичности (при окраске или обесцвечивании), в 18% гель добавлялиглицерин до конечной концентрации 5%. На разделяющий гель осторожнонаслаивали воду для предотвращения подсыхания верхнего слоя. После 2030мин.смоментаполимеризацииразделяющегогеля,заливаликонцентрирующий гель таким образом, чтобы расстояние между нижнейграницей концентрирующего геля и дном «кармана» для нанесения образцасоставляло не менее 15 мм.
Состав концентрирующего геля: Т = 4,5%, С =6%; 125мм трис-HCl буфер (рН 6,8); 0,1% ДСН; 0,025% ТЕМЕД; 0,025%ПСА. После полимеризации концентрирующего геля в лунки вносили пробы,88которые заранее смешивали с буфером для нанесения (рН 6,8). Составбуфера для нанесения: 1 М трис-HCl буфер; 5% ДСН; 2% дитиотриэтола; 1%2-меркаптоэтанол;30%глицерина;0,001%бромфеноловогосинего(«свидетель»).
Перед нанесением пробы смешивали с буфером, кипятили2 мин. на водяной бане. Общая концентрация белка не превышала 100 мкг наодну лунку. В качестве электродного буфера использовали раствор,содержащий 25 мМ трис-HCl (рН 8,3); 0,192 М глицина; 0,1% ДСН. В ходеконцентрирования (1-2 час.) При напряжении 299 В ток не превышал 15-20мА для того, чтобы белок с наименьшей конвекцией поступал в гель. Послетого, как зона бромфенолового синего проходила границу разделения гелей,ток увеличивали до 40-45 мА при U=299 В. Как только «свидетель» достигалнижнего края пластины, ток выключали, пластину ПAAГ вынимали.
Дляокраски полипептидных зон гель фиксировали в течение 12-16 ч прикомнатной температуре в растворе 12,5% трихлоруксусной кислоты (ТХУ).Электрофореграммы окрашивали в течение 12-16 ч в 0,1% растворе кумасиG-250, растворенном в 50% этаноле и 15% уксусной кислоте.
Гели, которыеприменяли для иммунохимического выявления ГФКБ, после окончанияэлектрофореза промывали в дистиллированной воде для того, чтобы удалитьизбыток ДСН.Иммуноэлектрофоретические методыИммуноэлектрофорез (ИЭФ) сочетает электрофорез и иммунодиффузию.Метод,вкоторомтехникаэлектрофорезабыласоединенасиммунодиффузионным анализом, впервые был предложен в 1952–1953гг.П. Н. Грабаром и К. Вильямсом (P. Grabar, С.
Williams) [502]. Однакоширокое использование метод приобрел лишь в конце XX столетия. Принципзонального иммуноэлектрофореза (электрофореза на носителях) заключаетсяв том, что образец антигенного материала распределяют с помощьюэлектрофореза в геле (обычно агарозном), в результате чего формируютсяхарактерные зоны. Параллельно зонам электрофореза в виде узкой полосы89вноситсяантисыворотка.Антигеныиантисывороткадиффундируютнавстречу друг другу. В ходе диффузии антигенов и антисывороткиобразуютсянерастворимыеиммунопреципитации,иммунодиффузииииммунныеимеющиеэлюированияформукомплексыдуг.–Посленепреципитованыхлиниипроведениямолекул,гельокрашивают специальными красителями (например, амидочерным 10В,азокармином В, суданом черным В и др.). Существует ряд модификацийметода ИЭФ, например, с помощью чистого антигена, с помощьюмоноспецифической антисыворотки, метод ИЭФ по Оссерману, метод ИЭФпо Геремансу и др. [503].
В настоящее время разработано более 20 вариантовиммуноэлектрофореза. Быстрое развитие метода обусловлено его высокойчувствительностью и абсолютной специфичностью [504].Для всех типов иммуноэлектрофореза использовали трис-вероналовыйбуфер с ионной силой 0,02 (рН 8,6). Электрофорез проводили в 1% агарозномгеле с электроэндоосмосом mr=-0,13. Гель готовили на трис-вероналовомбуфере, который в зависимости от растворимости белков, содержал от 0,1 до5,0% тритона Х-100. Слой геля имел толщину 0,15 см.
Количествоантисыворотки, которую вносили в гель, подбирали экспериментальнымпутем. При проведении обычного зонального электрофореза в агарозенапряжение электрического поля составляло 10 В/см, продолжительность –60мин.Припроведениииммуноэлектрофорезавагарозномгеле,содержащем антисыворотки, напряжение электрического поля составляло1,5-2 В/см, продолжительность – 16-18 час. По окончании электрофореза напластины с гелем наносили дистиллированную воду и пять слоевфильтровальной бумаги. Пластины отжимали под прессом в течение 10-15мин.Послеудаленияфильтровальнойбумаги,пластинысгелемвыдерживали 15 мин. в 0,1 М растворе NaCl.
Для удаления белков, которыене преципитировали, процедуру отжима-набухания геля повторяли трижды.Пластины с гелем высушивали потоком теплого воздуха и окрашивали 0,5%кумаси голубым R-250 в течение 15 мин. Краситель растворяли в смеси90этанола,ледянойуксуснойкислотыидистиллированнойводы(всоотношении 4,5:1:4,5). Дальнейшее обесцвечивание геля проводили в смесиэтанола, уксусной кислоты и дистиллированной воды в том же соотношении.Перекрестный иммуноэлектрофорезМетодявляетсякомбинациейзональногоэлектрофоретическогоразделения белков в агарозном геле с электрофорезом в геле, в которомприсутствуют антитела.
Электрофорез повторяют дважды. Вторично техникуэлектрофореза воспроизводят в направлении, который перпендикуляреннаправлениюпервогопроцесса.Перекрестныйиммуноэлектрофорезприменяли для проверки специфичности и титра антисывороток иидентификации антигенов. Для проведения зонального электрофореза впервом направлении использовали пластины размером 7х7. Препаратантигенов вносили в лунки и разделяли в условиях, описанных в п.2.5.2.После окончания электрофореза, полоску геля с антигеном размером 2х5 смотрезали с помощью скальпеля и переносили на катодную сторону пластины,которая имела размер 5х7 см.
Затем с анодной стороны заливали агарозныйгель, который содержал антитела к ГФКБ, и проводили иммуноэлектрофорезвперпендикулярномнаправлении.Порезультатамперекрестногоиммуноэлектрофореза обнаружено, что антисыворотка реагирует только ссоответствующими антигенами (ГФКБ) головного мозга животных разныхтаксонов и человека.Наличие только одного пика преципитации в каждом случае четкоуказываетнамоноспецифичностьантисыворотки.Примерпроверкиспецифичности антисыворотки против ГФКБ (в разведении 1:120) из мозгачеловека и карася (Carasius) показан на рис. 2.6.91.АБРис.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
