Диссертация (1151316), страница 16
Текст из файла (страница 16)
2.6 Перекрестный иммуноэлектрофорез фракций С 1 мозга карася (А) ичеловека (Б) (объем пробы – 10 мкл на лунку)← – электрофорез в первом направлении (60 мин, 10 В/см);↑ – электрофорез во втором направлении (12 ч, 2 В/см);Установлено, что иммуноглобулины кролика одинаково эффективнореагировали с антигенными эпитопами ГФКБ мозга карася и человека, чтосвидетельствует об относительной видонеспецифичности белка глиальныхпромежуточных филаментов.Ракетный иммуноэлектрофорезРакетныйсодержанияиммуноэлектрофорезнейроспецифическихиспользовалибелков.Данныйдляопределенияметоддостаточночувствителен и позволяет выявить до 10 мг/л антигена. В этой модификациииммуноэлектрофореза антисыворотки смешивают с агаром, а антиген вносятв подготовленные лунки.
После окончания электрофореза, благодаряобразованиюнерастворимыхиммуноглобулиновиммунныхантисыворотки,комплексоврезультатыантигеновиракетногоиммуноэлектрофореза проявляются в виде пиков преципитации, имеющихформу «ракеты» [504]. Пример ракетного иммуноэлектрофореза белков мозгакарася (Carasius) и солнечного окуня (Lepomis gibbosus) с антисывороткойпротив ГФКБ в разведении 1:50 представлен на рис. 2.7.92Рис. 2.7 Ракетный иммуноэлектрофорез белковых фракций головного мозгакарася (к) и солнечного окуня (с) (5 мкг белка на лунку)к і с – контрольные группы рыб;кAl і сAl – группы рыб, которые содержали в воде с добавлением Al3+;Для проведения ракетного иммуноэлектрофореза использовали 1%раствор агарозы , разогретый до температуры 55-600C.
Агарозу готовили на20 мМ трис-барбиталовом буфере (рН 8,6), который дополнительно содержал0,2% тритона Х-100. К жидкому гелю добавляли моноспецифическуюантисыворотку против ГФКБ и осторожно наносили на стекляннуюпластинку. После застывания геля со стороны катодного электрода отрезалиполосу высотой 1,5 см и на ее место добавляли соответствующий объемчистого геля, в котором делали лунки и вносили в каждую по 5 мкл объемаэкспериментальных проб. Для обеспечения прохождения тока через системуна пластину геля накладывали смоченные в электродном буфере «мостики»изхроматографическойбумаги.Вкачествеэлектродногобуфераиспользовали трис-барбиталовый буферный раствор.Электрофорез проводили в течение 16 ч при напряжении на поверхностигеля 2 В/см.
После окончания электрофореза пластину отжимали иотмачивали два раза в 0,9 % NaCl (для удаления свободных молекул белков).Отжатые гели высушивали при температуре 1500C. Окраску проводили втечение 10-15 мин с помощью раствора кумаси R-250 в смеси 45% этилового93спирта и 10% уксусной кислоты. Для обесцвечивания применяли смесь 45%этиловогоспиртаи10%уксуснойкислоты.Содержаниенейроспецифических белков выражали в условных единицах, равныхплощади (мм2) соответствующих иммунопреципитатов, в расчете на 1 мкгобщего белка соответствующей фракции.Для определения ГФКБ также использовали иммуноблотинг, с учетомтого, что в состав глиальных филламетных структур входят субъединицы снесколько отличной молекулярной массой (Мm).
Ограниченный протеолизинтактного полипептида с Мm 49 кДа может приводить к увеличениюколичестваэпитоповГФКБ[505].ИммуноблотингГФКБпослепредварительного электрофоретического разделения позволяет оценитьотносительноеколичестводеградированных),анеотдельныхтолькополипептидовопределять(встепеньтомегочислеобщейиммунореактивности.Метод иммуноблотингаИммуноблотинг является методом исследования белковых антигенов,относящийся к разновидностям гетерогенного иммунохимического анализа.В ходе иммуноблоттинга белки разделяют с помощью электрофореза ипереносят с одного твердого носителя на другой для дальнейшегоиммуноспецифическогообнаружения.Переносбелковизгелейнанитроцеллюлозу, которая наиболее распространена среди сорбентов, можетпроисходить пассивно (путем диффузии) или активно (под действиемэлектрического поля).
Последний вариант является наиболее быстрым иэффективным [506].Иммуноблотинг цитоскелетных и мембранных белков мозга проводилипо методу Товбина (Н. Towbin) [507]. После проведения электрофореза напластину ПААГ накладывали нитроцеллюлозные мембраны с диаметром пор0,27 мкм и размещали между стопками влажной фильтровальной бумаги дляфиксирования. Собранную таким образом систему вкладывали между двумя94поролоновымипрокладкамиизажималисдвухсторонжесткимиполимерными пластинами, которые имели отверстия для свободного доступаэлектролита к гелю, что обеспечивает прохождение тока через систему.Прибор располагали между электродами в камере с 12,5 мМ трис-HClбуфером (рН 8,3), который дополнительно содержал 0,1975 М β-аланина,30% этанола и 2 М мочевины.
Перенос белковых зон осуществляли в течение75-90 мин при напряжении 299 В и токе 150-170 мА. После завершенияпереноса мембраны отмывали от остатков буфера в пяти сменахзабуференного физиологического раствора (рН 7,0-7,2), содержавшегодетергент 0,05% Tween-80.Необходимо учитывать, что белки сорбируются на нитроцеллюлозунеспецифически, поэтому, перед дальнейшим их иммунохимическимвыявлением,возникаетнеобходимостьблокировкисвободныхместсвязывания иммуноглобулинов антисыворотки. Основным требованием,которое предъявляется к блокирующему агенту, является его полнаяиммуноинертность.Блокировкупроводилисывороткойкровибыка,разбавленной забуференным физиологическим раствором (ЗФР) или 5%раствором овальбумина, в соотношении 1:6, в течение 12-16 ч при t=4ºС (или3-5 ч при комнатной температуре).После блокировки нитроцеллюлозные мембраны инкубировали 12-16 чпри t= 4ºС с разведенной (1:1000) специфической кроличьей антисывороткойпротив ГФКБ.
Далее мембраны промывали в 5-7 сменах ЗФР с 0,05%Tween-80 и инкубировали 60 мин при комнатной температуре. После чегомембраны выдерживали при 37ºС в течение 45 мин с разведенными (1:1000)вторичнымипероксидазойантителамихрена.киммуноглобулинамАнтителавторойкролика,сыворотки,меченныхкоторыебылинеспецифически сорбированны, отмывали в 5-7 сменах ЗФР с 0,05%Tween-80.Длявизуализациииммунныхкомплексов,соответствующихполипептидным зонам ГФКБ, нитроцеллюлозную мембрану обрабатывали в95течение 10-15 мин при комнатной температуре в 50 мМ трис-HCl буфере (рН7,4), который содержал хромоген – 0,01% диаминобензидин, и 0,02%перекись водорода.
Мембраны высушивали в потоке воздуха.Метод иммуноблоттинга позволяет провести анализ состава отдельныхполипептидов(фрагментов),которыенесутидентичныеантигенныедетерминанты и определить их относительное содержание. Интенсивностьиммунного окрашивания определенной полипептидной зоны, способнойреагироватьсмоноспецифическихантисывороткой,пропорциональнаколичеству антигена [301, 508].Послепроведенияиммуноблоттинга,вобработкеданныхиспользовалась программа "LabWork_4.0" (UVP, Великобритания, 2001),которая применялась для сканирования и сравнения интенсивностиполипептидных зон на нитроцеллюлозной мембране. Интенсивность окраскизон полипептидов из мозга контрольных групп принимали за 1 (100%).Пример расчета относительного содержания ГФКБ в мозге карасяпредставлен на рис. 2.8.Содержаниенейроспецифическихбелковвыражаливусловныхединицах, которые рассчитывали по отношению величины относительнойплотности зоны (%) к содержанию белка в пробе (мкг).
Параллельнопроводили анализ количественного содержания белка методом ракетногоиммуноэлектрофореза. Погрешность двух методов оценивали с помощью Fкритерия Фишера. При достоверной разнице между двумя дисперсиями(P<0,05), вероятными считали результаты выборочных измерений, которыедавали меньшую величину показателя точности.Относительное содержание ГФКБ, %96250200150100500КPbРис. 2.8 Пример расчета относительного содержания ГФКБ в мозге карасяконтрольной группы (к) и при действии ионов свинца (Pb 2+) с помощью сканированияиммуноблотинга и анализа в программе “LabWork_4.0”Расчет показателя точности проводили по формуле (2.3):Csm100% ,M(2.3)где Cs – показатель точности;m – стандартная погрешность средней;M – средняя величина.Иммуногистохимический методВ исследовании компонентов цитоскелета астроглии тканей мозга in situприменяли метод, который основан на специфическом связывании антигенови антител, конъюгированных с пероксидазой хрена (КФ 1.11.1.7) [509].Декапитированные отделы мозга замораживали в криостате (t=-750С) и97готовили срезы толщиной 5 мкм.
Срезы высушивали при комнатнойтемпературе в течение 10 мин, фиксировали ацетоном при температуре 40С втечение 10 мин и промывали ЗФР. Эндогенную пероксидазную активностьблокировали 0,2% раствором Н2О2 в течение 15 мин. На срезы наносили 50мкл раствора кроличьей моноспецифической сыворотки анти-ГФКБ вразведении 1:150 и инкубировали во влажной камере в течение 60 мин притемпературе 370С. Срезы промывали ЗФР трижды и инкубировали сраствором антител к иммуноглобулинам кролика, конъюгированных спероксидазой.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
