Диссертация (1150552), страница 2
Текст из файла (страница 2)
Например, межмолекулярные дисульфидные мостикибыли непосредственно вовлечены в превращение нормальной клеточной формы прионногобелка в инфекционную форму [20]. В то же время дисульфид-связанные димеры белка tauпоказываютприон-подобныеОкислительныйстрессхарактеристики,приводиткиндуцирующиеобразованиюtau-патологиюдисульфид-связанных[21].агрегатовсупероксиддисмутазы SOD1, которые связаны с боковым амиотрофическим склерозом [22, 23].Тот же механизм применим для телец включений, образованных нейропатологическим белкомTDP-43, которые также связаны с боковым амиотрофическим склерозом, а также лобновисочной дегенерацией [24]. По всей видимости, такие дисульфид-связанные белковыеотложения образуются, когда клетка приближается к смерти, а редокс-гомеостаз сильнонарушен.
Тем не менее, они явно остаются ключевым элементом нейродегенерации ипотенциальной терапевтической мишенью [25].Спектроскопия ядерного магнитного резонанса для глобулярных белков позволяетполучить большой объем информации о процессах, происходящих при окислительном стрессе.Однако формирование агрегатных частиц делает невозможным применение стандартногоарсенала многомерной гетероядерной спектроскопии ЯМР. При этом информация о структуре и6способе формирования этих агрегатных частиц может быть чрезвычайно полезной дляразработки лекарств от нейродегенеративных болезней, сопровождаемых формированием телецвключения. По этой причине развитие методов ЯМР для изучения молекул белка вагрегированном состоянии является актуальной проблемой.Третьимтипомсистем,обсуждаемыхвдиссертации,являютсянативноразупорядоченные белки (IDP).
IDP являются белками без четко определенной вторичной итретичной структуры. Они составляют около 25% всех белковых последовательностей [26, 27].Их гибкость позволяет им связываться с несколькими мишенями и сворачиваться присвязывании [28]. По этой причине IDP представляют собой обширное многообразие белков,выполняющих многие важные функции такие, как регулирование клеточных процессов исигнализация [29]. В IDP конформационная гибкость является основной характеристикой,которая сохраняется в процессе эволюции [30].
Знание динамики для IDP необходимо длялучшего понимания функций IDP при нормальном гомеостазе и патологиях. В глобулярныхбелках динамика может быть описана локальными движениями отдельных частей иглобальными движениями белка целиком. Однако различие между этими двумя типамидвижения становится все более размытым, по мере уменьшения структурированности белка иувеличения его подвижности [31].Множество доступных IDP конформаций в некоторых случаях включает патогенныеформы. IDP являются основной составной частью белковых включений при болезняхАльцгеймера, Паркинсона и других нейродегенеративных заболеваниях [32, 33].Измерения ЯМР релаксации являются универсальным методом для исследованиядинамики белков. ЯМР релаксация 15N позволяет изучить функции спектральной плотности дляпептидной плоскости в белках. Тем не менее, зачастую сложно определить вклады отразличных мод движения белковой цепи.
Для решения этой задачи представляетсяперспективным использовать совместный анализ экспериментальных данных ЯМР имоделирования МД. Как будет показано ниже, нам удалось разобраться в иерархиидинамических мод.Все вышеописанное дает ответ, почему различные области биофизики и медициныпроявляют интерес к развитию новых методов и подходов в ЯМР спектроскопии,релаксометрии и диффузометрии для получения информации о сложных для изучениясостояний биологических молекул.7Цели и задачи работыЦелью данной работы является разработка методик ЯМР для изучения биологическихмолекул в состояниях, не позволяющих прямого наблюдения спектроскопией ядерногомагнитного резонанса. Методики продемонстрированы на примере аминокислот и их водногоокружения, олигомеров и агрегатных частиц белков, а также нативно разупорядоченныхбелков.
Для достижения цели были поставлены следующие задачи.1. На основе изучения данных ЯМР релаксации ядер растворителя разработатьметодику, позволяющую построить модель гидратного окружения ω-аминокислоти отдельных молекулярных групп, входящих в их состав.2. Идентифицировать моды молекулярного движения ответственные за процессЯМР релаксации атомов 15N в основной цепи нативно разупорядоченных белков.3. На основе методов ЯМР по возможности полно охарактеризовать структурные идинамические свойства белковых молекул при переходе из глобулярногосостояния к разупорядоченному, агрегированному состоянию под воздействиемокисляющих соединений.Научная новизна1. Применен новый подход к совместному анализу данных ЯМР релаксации иквантово-химических расчетов, который позволил описать водное окружениеорганических молекул в виде системы, в которую входят гидратные оболочкиотдельных гидрофильных и гидрофобных молекулярных групп.
Получены новыеданные о координационных числах и временах корреляции вращательногодвижения, а также их температурные и концентрационные зависимости, длямолекул воды вблизи отдельных молекулярных групп органических молекул вводных растворах.2. С помощью предложенного нового варианта ЯМР эксперимента для наблюденияH/D обмена амидных протонов основной цепи белка был доказан фактразупорядочивания белков на примере второго РНК-распознающего домена(RRM2) белка TDP-43 в составе агрегатных частиц, а также наличие обменамежду состояниями глобулярного растворимого белка и агрегатами помеханизму, основанному на реакции обмена тиол-дисульфид.3.
Данные о коэффициентах диффузии в полидисперсной системе, полученныеметодом ЯМР с импульсным градиентом магнитного поля и методом8динамического рассеяния света, впервые были совместно интерпретированы дляопределения функции распределения частиц по размеру.4. Впервые для двух доменов глобулярных белков, связанных в ненативный димерпосредством дисульфидной связи, проведено моделирование молекулярнойдинамики.5. Разработан метод для анализа траекторий МД для нативно разупорядоченногобелка, который позволил изучить по отдельности различные моды молекулярногодвижения в полипептидной цепи.Практическая ценность1. Разработанные методы исследования подвижности молекул воды вблизиотдельных молекулярных групп аминокислот, основанные на изучении ЯМРрелаксации ядер растворителя, могут быть использованы для полученияпараметров гидратации широкого спектра органических соединений.2.
С помощью новой методологии, развитой в диссертационной работе, становитсявозможным исследовать белки, подвергающиеся различным ковалентныммодификациям, которые приводят к нарушению структурной целостности и квозникновению агрегированного состояния, изучение которого другими методамине представляется возможным.3. Результаты, относящиеся к дестабилизации белка и формированию агрегатныхчастиц, позволяют по новому взглянуть на область рационального дизайналекарственных препаратов на основе пептидов, связывающихся ковалентно сосвоей мишенью. Такие пептиды могут формировать ковалентную связь сраспознаваемой мишенью и приводить к точечному воздействию на клеточныемеханизмы, тем самым приводя клетку к гибели.
Ряд подобных пептидов былразработанвлабораторииБиомолекулярногоЯМРСПбГУ.Онипродемонстрировали возможность успешного уничтожения раковых клеток(результаты опубликованы в работе [34]).4. Разносторонняя характеризация систем, подобных изученным RRM2 из TDP-43,является существенным вкладом в понимание нейропатологических процессов,вызванных окислительным стрессом.5. Анализ спиновой релаксации ядер15N в нативно разупорядоченном белкепоказал, что в современной литературе представлено неполное описание моддвижения, отвечающих за ЯМР релаксацию. Новые данные, полученные из9совместной интерпретации данных ЯМР релаксации и МД, позволили внестиясность в данный вопрос.Основные положения, выносимые на защиту1. Сочетание метода ЯМР релаксации с квантово-химическими расчетами позволяетопределять времена корреляции вращательного движения молекул воды вгидратном окружении отдельных функциональных групп органических молекул сбольшей достоверностью.
В частности, было установлено: (i) времена корреляциивращательного движения молекул воды вблизи гидрофобной метиленовой группыв 1,5-2 раза длиннее, чем у объемной воды, в температурном диапазоне от 2 до75˚C; (ii) времена корреляции вращательного движения молекул воды вгидратных оболочках гидрофильных групп немного длиннее, чем в объемнойводе при температурах выше 60°C, но при более низких температурах онисоставляют 0,8 ÷ 1,0 от значений времени корреляции для объемной воды.2. Разработанный новый ЯМР-эксперимент на базе1H,15N HSQC позволяетопределять скорости H/D обмена в агрегатных частицах белков, формирующихсяпри окислительном стрессе. Данные по H/D обмену, наблюдаемому с помощьюэтого метода на изотопно-меченных образцах белка RRM2 показывают, что (i)дисульфид-связанные димеры могут служить зародышем агрегации белков, (ii)формируемые агрегатные частицы включают в себя не только развернутыедимеры и олигомеры, но и развернутые мономеры, (iii) между фракциейрастворимых мономеров и агрегированным белком происходит обмен за счетобменной реакции тиол-дисульфид.3.
На основе данных ЯМР по H/D обмену, рефолдингу и компьютерногомоделирования МД установлено, что дисульфид-связанные агрегаты (димеры иолигомеры) перешедшие в развернутое состояние под действием большойтепловой флуктуации, обладают низкой способностью к рефолдингу. Этоприводиткпостепенномупереходубелкаотнативногосостояниякразупорядоченному.4.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
