Диссертация (1150338), страница 12
Текст из файла (страница 12)
Это можно объяснить тем, что расстояниемежду наноструктурами меньше толщины диффузионного слоя (то естьнаноструктуры плотно упакованы на поверхности) и наблюдаемое ограничениетоков окисления и восстановления объясняется линейной диффузией, что хорошосогласуется с литературными данными [93, 152].Выбор потенциала измерений для построения градуировочной зависимости исостава фонового раствора. Фоновый электролит состоял из 5∙10-4 Мферроценметанола в 0,1 М растворе фосфатного буфера (NaH2PO4+Na2HPO4) (pH1007). Выбор фонового электролита обусловлен потребностью в измеренииконцентрации глюкозы в биологических средах. Выбранный натрий-фосфатныйбуфер является изотоническим раствором, что делает его подходящим дляисследований поведения электрохимического биосенсора в биологических средах.Привведениивсистемуглюкозыпроисходитреакцияокислениядоглюконолактона, при этом глюкозоксидаза переходит из окисленной формы ввосстановленную.
Ферроценметанол восстанавливается глюкозоксидазой, такимобразом, на электроде регистрируется ток, соответствующий процессу окислениядиффузионного медиатора, который пропорционален концентрации глюкозы врастворе.Исходяизвышесказанного,регистрациюсигналаоткликаэлектрохимического биосенсора нужно проводить при потенциале окисленияферроценметанола.Определение глюкозы с использованием вольтамперометрического сенсора наоснове рабочего электрода, модифицированного химически синтезированныминаноструктурами золота.Были определены интервал линейной зависимости тока от концентрацииглюкозы, чувствительность, предел обнаружения, стабильность и селективностьбиосенсора.Определениеглюкозыбыловыполненонаэлектроде,модифицированном наноструктурами золота in situ, а также глюкозоксидазой,ковалентно «пришитой» к наноструктурированной поверхности электрода.Детектирование концентрации глюкозы было проведено методом циклическойвольтамперометрии, диапазон развертки потенциала составлял от минус 0,1доплюс 0,55 В (рисунок 41).
Значение потенциала для построения градуировочнойзависимости при этом был выбран равным плюс 0,250 мВ, так как такой выборотвечает максимальному значению аналитического сигнала. Были построеныеградуировочные зависимости тока окисления фероценметанола от концентрацииглюкозы (рисунок 42-43)101Рисунок 41. Циклические вольтамперограммы на модифицированномэлектроде, с различной концентрацией глюкозы в ячейке в диапазонеконцентраций от 0 до 20 мМ.Рисунок 42. Зависимость величины тока (E=+250 мВ) от концентрацииглюкозы на циклических вольтамперограммах для трех модифицированныхэлектродов.102Рисунок 43. Градуировочная зависимость для биосенсора на основенаноструктур Au (а), а также градуировочная зависимость для биосенсора наоснове тонкопленочного золотого электрода (б) (зависимость высоты пикаокисления ферроценметанола от концентрации глюкозы).Из полученных градуировочных зависимостей можно сделать вывод о том,что чувствительность электрода, модифицированного наноструктурами золотаувеличилась практически в два раза (от 0,8 до 15 мкА/(мМ·см2)).Одной из важнейших характеристик биосенсора является его стабильностьво времени.
Измерения стабильности биосенсора проводили в течение 60 дней, спериодичностью 5 дней в интервале концентрацийот 0,06 до 18,5 мМ. Нарисунке 44 представлена динамика относительной чувствительности биосенсора(отношение результатов чувствительности, полученных через N дней к значению,измеренному в начальный период времени) на основе наноструктурированногоэлектрода и тонкопленочного золотого.103Рисунок 44. Зависимость относительной чувствительности от временидля биосенсора на основе электрода модифицированного наноструктурамизолота (1) и тонкопленочного золотого электрода (2).Спустя 60 дней биосенсор на основе наноструктур золота, обработанныхреагентом Меервейна показал значение относительной чувствительности 93%, втовремякакотносительнаячувствительностьбиосенсоранаосноветонкопленочного золотого электрода снизилась до 67% (рисунок 44).
Это связанос тем, что, как описано в литературе, наноструктуры золота предотвращаютденатурацию молекул глюкозоксидазы иммобилизованной на поверхности [153].Полученные результаты свидетельствуют о том, что полученный биосенсоробладает существенно большей стабильностью по сравнению с тонкопленочныммодифицированным электродом. Сравнительные аналитические характеристикибиосенсора на основе наноструктур золота, синтезированных олеиламиновымметодом и обработанных реагентом Меервейна, приведены в таблице 9.104Таблица 9. Аналитические характеристики биосенсора на основе наноструктурзолота.
ЛИ – линейный интервал; ПО – предел обнаружения; S –чувствительность; Eдет – потенциал детектирования; НЧ – наночастицы; GOX–глюкозоксидаза;модификаторПО,СтабильностьмM(дней)15,00,0293% (60)0,02-5,78,80,008270% (30)[154]0,01-135,70,00885% (28)[155]0,2-1,810,50,06495% (14)[156]ЛИ, мMS, мкA·мM-1cм-2НС Au0,06 – 18,5НЧ Au(НЧ Au)6электродамультислоиграфенаСсылканаст.работаСелективность биосенсора определялась по отношению к мочевой кислоте,этанолу и аскорбиновой кислоте (таблица 10). Такой выбор объясняется тем, чтоданные вещества присутствуют в биологических системах и оказываютнаибольшее влияние на аналитический сигнал глюкозы в биосенсоре.
Так,аскорбиноваякислотавосстанавливаетферроценметанол,такимобразом,завышая сигнал биосенсора. Этанол и мочевая кислота меняют отклик сенсора,так как в незначительных количествах взаимодействуют с отдельными участкамиглюкозоксидазы.105Таблица 10. Влияние некоторых электроактивных метаболитов на откликбиосенсора на основе наноструктур золота в присутствии 1,5 мМ глюкозы врастворе. % отклика биосенсора – отношение сигнала в присутствии к сигналу вотсутствие мешающего вещего вещества.% отклика биосенсора (n=3)Мешающее веществоGOx-AuNPМочевая кислота, 2,5мMЭтанол, 0,1 v/v %Аскорбиновая кислота,2,5 мM98101111Для проверки работы сенсора на реальных объектах было проведеноопределение глюкозы в сыворотке крови человека (Sigma Aldrich) методомвведено-найдено (таблица 11).
Концентрация глюкозы в сыворотке кровисоставляло 6,4 мМ. Образец разбавляли в 10 раз в растворе фонового электролита.106Таблица 11. Данные по определению глюкозы предложенным биосенсором,методом введено-найдено.Начальнаяконцентрацияглюкозы в образцеВведено глюкозы, Найдено глюкозы,ОпределеномMмMглюкозы, мM0,640,501,130,49±0,010,643,03,522,88±0,120,646,06,585,94±0,060,6412,012,4511,81±0,24сыворотки крови,мM,Приведенные в таблице 11 результаты абсолютной погрешности найденныхконцентраций глюкозыприводят к выводу о соответствии введенных инайденных концентраций. Олеиламиновый метод синтеза наноструктур золота, сдальнейшейобработкойреагентомМеервейна,позволяетполучитьнаноструктуры золота, использование которых для дальнейшей модификацииэлектродовприводиткполучениювысокочувсвительныхистабильныхвольтамперометрических сенсоров для определения глюкозы.1074.1.1.
Расчет каталитической активности глюкозоксидазы из данныхполученных при определении глюкозыРасчет кажущейся константы Михаэлиса выполняли из данных, полученныхметодом циклической вольтамперометрии при измерении зависимости значенийтока окисления ферроценметанола от концентрации глюкозы в растворе.Константа Михаэлиса рассчитывалась из кинетической зависимости скоростиреакции от концентрации субстрата (в данном случае глюкозы) по формуле (1).Данное равенство допустимо только в случае кинетического режима работысенсора, так как именно в этом режиме сигнал сенсора определяется неградиентомконцентрацииглюкозы,аисключительнокинетическимипараметрами.
Кинетический режим соответствует области задания высокихконцентраций аналита в ячейке. Такая область соответствует интервалу переходаот линейной зависимости тока от концентрации глюкозы к экспоненциальной. Наосновании вышеизложенного был проведен расчет константы Михаэлиса, дляэтого была построена обратная зависимость концентрации глюкозы от тока, затемвыделен участок перехода из диффузионного режима в кинетический. Длявыделенного участка была проведена линейная аппроксимация, по результатамкоторой по формуле (1) была рассчитана кажущаяся константа Михаэлиса (Kmapp)(рисунок 45).Значение константы Михаэлиса (Kmfree) для глюкозоксидазы составляет от33 до 110 мМ, при ее получении из плесневых грибов Aspergillus niger [157, 158].Известно, что соотношение между Kmapp and Kmfree может изменяться взависимости от условий иммобилизации фермента на поверхности [159].
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
