Диссертация (1150338), страница 13
Текст из файла (страница 13)
Влитературе кажущаяся константа Михаэлиса для различных электродов,модифицированных глюкозоксидазой: 4,3 мM [154], 6,7 мМ [87], 10,5 мМ [89],14,9 мM [90], 20 мM [91], и 6,3 мM [160].Дляглюкозоксидазы,иммобилизованнойназолотомэлектроде,предварительно in situ модифицированном наноструктурами золота, была108рассчитана кажущаяся константа Михаэлиса. Значение Kmapp составило 10,5 мМ.Такое значение Kmapp хорошо согласуется со значениями для биосенсоров,приведенных в вышеуказанной литературе.Рисунок 45. Обратные зависимости тока окисления ферроценметанола отконцентрации глюкозы в ячейке для расчета кажущейся константы Михаэлиса.Полученное значение константы Михаэлиса свидетельствует о сохраненииактивности глюкозоксидазы после иммобилизации и в течение измеренияконцентрации глюкозы.4.2.Исследование аналитических характеристик электродов на основенаноструктурированных УМЭ Au, Pd сплава Pd-Au на примерепероксида водородаЭлектрохимические биосенсоры, содержащие ферменты, имеют ряд недостатков,которые ограничивают их практическое применение.
Использование бесферментныхсенсоров на основе наноструктурированных электродов благородных металловпозволяетпроводитьЭлектрохимическиеанализбиологическихбесферментныеобъектовсенсоры(см.сочетаютраздел1.6).преимуществаэлектрохимических методов и уникальные свойства наноматериалов, что позволяетзначительно увеличить чувствительность и уменьшить продолжительность анализа.Стабильность и интенсивность аналитического сигнала электрохимических сенсоровувеличивают такие перспективные наноматериалы как наночастицы Au, Pt и Pd. Издовольно широкого круга биологических аналитов наиболее важным является109пероксидводорода.Детектированиепероксидаводородапроводятвфармацевтических исследованиях, в медицинской диагностике и для контроляокружающей среды.
Также пероксид водорода вовлечен в различные биологическиепроцессы, включая внутриклеточный обмен и является продуктом деятельностиоксидоредуктаз.4.2.1. Аналитические характеристики амперометрического сенсора наоснове наноструктурированных УМЭ на примере бесферментногоопределения пероксида водородаВыбор состава фонового электролита. В качестве фонового электролита былвыбран 0,1 М фосфатный буферный раствор (NaH2PO4+Na2 HPO4) с pH 7,2, таккак он является раствором близким по составу к физиологической жидкости и непредставляет токсичности при измерениях в среде клеточных структур.Выбор потенциалов определения пероксида водорода. В соответсвии смеханизмом, представленным в главе 1.6, процесс электровосстановленияпероксида водорода на поверхности электрода будет включать в себя этападсорбции гидроксильного радикала или пергидроксильного радикала наповерхности электрода, с образованием так называемой «оксидной пленки».
Втакомслучае,аналитическимсигналомбудетслужитьвосстановлениеповерхности электрода с последующей десорбцией кислорода при потенциалеэлектровосстановления соответствующего металла. Для выбора потенциаладетектированиябылпроведенанализданныхметодомциклическойвольтамперометрии на наноструктурированных УМЭ Au, Pd и сплава Pd-Au врастворе фонового электролита. Объем ячейки для измерений методомциклической вольтамперометрии составлял 1 мл, а для измерений методомамперометрии–100мкл.Потенциалывосстановленияповерхностинаноструктурированных УМЭ для Au и Pd из оксидов составили плюс 0,48 иминус 0,2 В соответственно (рисунок 46а-б).110Потенциалы восстановления из оксидных форм на катодной ветвициклических вольтамперограмм в сплаве для Pd и Au (рисунки 46а-б) былиопределены как минус 0,12 В и плюс 0,05 В соответственно.
Такое смещениепотенциалов связано с тем, что потенциалы восстановления каждого металлазависят от суммарного восстановительного потенциала сплава и концентрациикаждого металла в сплаве [161]. На основании вышеизложенного и полученныхданныхвосстановительныхпотенциаловбылополученодополнительноедоказательство о том, что состав сплава соответствует образованию твердогораствора. Для детектирования пероксида водорода на наноструктурированномУМЭ состава Pd-Au, исходя из информации, извлеченной из циклическихвольтамперограмм, был выбран потенциал детектирования минус 0,05 В.Рисунок 46.
Циклическая вольтамперограмма наноструктурированногоУМЭ Pd в фоновом растворе (а2) и наноструктурированного УМЭ сплава Pd-Au(а1). Циклическая вольтамперограмма наноструктурированного УМЭ Au вфоновом растворе (б2) и наноструктурированного УМЭ сплава Pd-Au (б1).Определение пероксида водорода на Pd и Au нанструктурированномэлектродах. Определение пероксида водорода проводилось в фоновом растворефосфатного буфера (pH 7,2) в ячейке объемом 100 мкл методом амперометрии. Вкачествесравнения,определениепероксидаводородапроводилосьнананоструктурированных УМЭ Au и Pd, методом амперометрии, при потенциалах111детектирования плюс 0,48 В и минус 0,2 В соответственно и были построеныградуировочные зависимости (рисунок 47-48).бI, нАаt, cвРисунок 47 Амперограмма измерений добавок пероксида водорода нананоструктурированном УМЭ Pd (а), градуировочная зависимость токавосстановления палладия от концентрации пероксида водорода (б), фотографиянаноструктурированного УМЭ палладия в оптическом микроскопе (в)112бI, нАаt, cвРисунок48.Амперограммаизмеренийдобавокпероксидаводороданананоструктурированном УМЭ Au (а), градуировочная зависимость токавосстановления золота от концентрации пероксида водорода (б), фотографиянаноструктурированного УМЭ золота в оптическом микроскопе (в).Наноструктурированные УМЭ Pd и Au использовались в качествеэлектродов для детектирования пероксида водорода.
Это позволило повыситьчувствительностьбесферментногосенсораидостичьнизкихпеделовобнаружения при использовании малых объемов раствора (до 100 мкл) (таблица12). Однако оба электрода имеют небольшой интервал линейной зависимоститока восстановления металлов от концентрации пероксида водорода.113Таблица 12.
Аналитические характеристики бесферментных электрохимическихсенсоров для определения пероксида водорода. ЛИ – линейный интервал; ПО –предел обнаружения; S – чувствительность; Eдет – потенциал детектирования;НЧ – наночастицы; НС – наноструктуры; МУНТ – многостенные углеродныенанотрубки; ПАН – полианилин; ОГ - оксид графена..модификаторS, мА∙мМ-1∙см-2 Eдет, В СсылкаЛИ, МПО, МНС УМЭ Au2,0·10-4÷1,0·10-25,9·10-50,0520,48НС УМЭ Pd1,0·10-5÷7,9·10-36,0·10-60,162-0,2НС УМЭ Pd/Au1,0·10-6÷1,0·10-32,4·10-74,176-0,05НЧ Au73Ag271,0·10−5÷7,0·10−51,0·10-60,008 мА∙мМ-1-0,65[162]НЧ Pd1,0·10−6÷8,2·10−46,8·10-7--0,45[163]7,0·10−6÷2,5·10−32,0·10-60,748-0,25[164]6,0·10−6÷1,8·10−27,0·10-7 0,0624 мА∙мМ-1-0,40[165]электродаНЧ Pt/МУНТПАННЧ Ag/хитозан-ОГданнаяработаданнаяработаданнаяработаДинамическоий диапазон концентраций пероксида водорода для УМЭ Pdохватываетболеенизкуюобластьконцентраций,чемAu.ДляAuнаноструктурированного УМЭ, диапазон линейной зависимости концентрациинаходится в области более высоких концентраций пероксида водорода.
Можноожидать, что на наноструктурированном УМЭ сплава Pd-Au диапазон линейной114зависимости концентраций пероксида водорода будет находиться в болеешироком интервале, а также проявится кумулятивный эффект и возрастетчувствительность бесферментного электрохимического сенсора.ОпределениепероксидаводороданаPd-Auнаноструктурированномэлектроде. Определение пероксида водорода на наноструктурированных УМЭсплава Pd-Au (см. рисунок 49а) выполняли в фоновом растворе фосфатногобуфера (pH 7,2) в ячейке объемом 100 мкл методом амперометрии (см. рисунок49б). Определение пероксида водорода проводилось на наноструктурированныхУМЭ сплава Pd-Au, методом амперометрии при потенциале минус 0,05 В.Потенциал детектирования был выбран в более отрицательной области, чтобыпроисходило восстановление оксидных форм обоих металлов (см.
рисунок 49в).По полученным данным были построены градуировочные зависимости (см.рисунок 49г).115абвгРисунок 49. Фотография сплава Pd-Au в оптическом микроскопе (а),амперограммаизмеренийнаноструктурированномдобавокэлектродепероксидасплаваPd-Auводорода(б),нациклическаявольтамперограмма сплава Pd-Au в растворе фонового электролита и сдобавкой пероксида водорода в ячейке 1∙10-2М(в), градуировочная зависимостьтока восстановления сплава Pd-Au от концентрации пероксида водорода (г).Проанализировав все вышеперечисленныеданные,полученные приопределениии пероксида водорода на наноструктурированных УМЭ (таблица 12),можно сделать вывод о том, что полученные амперометрические сенсоры наоснове наноструктурированных УМЭ Pd, Au и сплава Pd-Au могут бытьиспользованы для высокочувствительного и точного детектирования уровняпероксида водорода в объеме 100 мкл.Чувствительность наноструктурированных УМЭ сплава Pd-Au много вышепо сравнению с Au наноструктурированными УМЭ (5,7·10-7 A/мM) и Pd (5,4∙10-7116A/мM).
В [20] при определении пероксида водорода на кристаллах палладия нананочастицах золота, при том же потенциале детектирования, линейный интервалзависимости концентрации пероксида водорода составил от 1мкM до 10 мM.Чувствительность бесферментных сенсоров представленных в литературе [166]схожа и составляет 17,4 мкА/мМ. Предел обнаружения на порядок ниже длясинтезированных наноструктурированных УМЭ сплава Pd-Au, чем полученныйнананокристаллах[166](1мкМ).Такимобразом,былиполученыамперометрические сенсоры для определения пероксида водорода с большейчувствительностью, чем в литературе [101, 102].Полученная высокая чувствительность в сочетании с малым объемомраствора (до 100 мкл) позволили использовать наноструктурированные УМЭ дляэлектрохимическогоопределенияпероксидаводорода,втомчислевбиологических жидкостях.4.2.2.
Определение внеклеточной концентрации пероксида водорода пригипоксии клеток HL-1Для проверки биосовместимости бесферментного электрохимического сенсорадля определения пероксида водорода был использован метод гипоксииклеточных культур на поверхности подложки с наноструктурированным УМЭ.В качестве клеточной культуры использовали раковые клетки сердечныхмышц HL-1. Количество клеток на чипах составляло ≈0.036∙106. В процессегипоксии в клетках появляется недостаток кислорода, что приводит костановке метаболических процессов. При возобновлении потреблениякислорода в клетках происходит более интенсивный процесс метаболизма иэтоприводиткувеличениюконцентрациипероксидаводородавовнутриклеточной и внеклеточной средах.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
