Диссертация (1150273), страница 9
Текст из файла (страница 9)
Объем составил 2 мл.Оптическая плотность1.41.210.8y = 0.0059x + 0.0104R² = 0.9980.60.40.20050100150200250С антипирина, мкМРисунок 32. Градуировочный график для определения антипирина вслюне методом ЦИА с МЭДЭ полярным растворителем (0,2 М растворH2SO4, 6 мМ раствор NaNO2, экстрагент – хлористый метилен, диспергатор –ацетонитрил).Было показано, что полярный растворитель (ацетонитрил) с однойстороны обеспечивает эффективное диспергирование экстрагента в воднойфазе, но с другой, как это видно из рисунка 31Б, увеличивает оптическуюплотность холостой пробы, а, следовательно, снижает чувствительностьопределения. Для преодоления этого недостатка была изучена возможностьдиспергирования экстрагента газовой фазой, образующейся в результатехимической реакции [56]. Такой способ диспергирования экстрагента не былреализован в проточном анализе.Для ЦИА с микроэкстракционным выделением при диспергированииэкстрагента газовой фазой потребовалось разработать и включить в схемуанализа многоканальную смесительную камеру (Рисунок 33), представляющую56собой монолитную ячейку из тефлона (высота – 50 мм, внутренний диаметр –10 мм), имеющую сверху, снизу и сбоку каналы.В качестве газа диспергатора использовали CO2, образующийся врезультате реакции карбонат-ионов при подкислении.Рисунок 33.
Схема ЦИА, включающая дериватизацию с последующиммикроэкстракционым выделением и концентрированием деривативов избиологических жидкостей при диспергировании экстрагента газовой фазой,образующейся в результате химической реакции.Было исследовано три различных способа подачи водных растворов всмесительную камеру (Рисунок 34). Во всех случаях растворы карбоната натрияи уксусной кислоты смешивались в смесительной спирали (1). После этого,смешанный раствор подавался в камеру с раствором 4-нитрозоантипирина: впервом режиме (Рисунок 34А) эта водно-газовая смесь подавалась черезнижний канал камеры (а), в то время как хлористый метилен (экстрагент)подавался через боковой канал камеры (б); во втором режиме (Рисунок 34Б) –через нижний боковой канал камеры (б), а хлористый метилен – через нижнийканал (а); в третьем режиме (Рисунок 34B) через нижний канал камеры (а), аэкстрагент подавался через верхний канал (в).
Во всех случаях после57проведения экстракции органическая фаза, содержащая аналит, извлекалась изнижнего канала (а) и подавалась в проточную кювету детектора.Рисунок 34. Схемы инжекции растворов реагентов и экстрагента всмесительную камеру (А, Б, В); Зависимость оптической плотности экстрактаот схемы подачи фаз в смесительную камеру (Г).Критерием выбора оптимальной схемы подачи растворов был высокийаналитический сигнал. Результаты показали, что третий противоточный режимподачи реагентов является наиболее подходящим (Рисунок 34Г). В этом случаепроисходит образование пузырьков CO2 in situ, а подача экстрагентапроисходит в противоточном режиме, что повышает эффективность егодиспергирования и увеличивает эффективность экстракции.58Для оптимизации циклического инжекционного определения антипиринас микроэкстракцией при диспергировании экстрагента газовой фазой былоизучено влияние скоростей потоков растворов реагентов на величинуаналитического сигнала и СКО.
Скорость потока растворов CH3COOH иNa2CO3 варьировали в диапазоне от 0,5 до 5 мл/мин.Для этого в смесительную ячейку (4) (Рисунок 33) подавали 1 мл 100мкМ раствора антипирина (а), 1 мл 0,2 М H2SO4 (б) и 1 мл 6 мМ NaNO2 (в).Растворы перемешивались потоком азота (г) при комнатной температуре от 1до 10 мин. На следующем этапе через многоходовый кран – переключатель (1)с помощью мультишприцевого насоса в смесительную камеру со скоростьюпотока от 0,5 до 5 мл/мин подавали 300 мкл 0,5 М Na 2CO3 (д), 300 мкл 1 МСН3СООН (е), 300 мкл хлористого метилена (ж).
Растворы в смесительнойячейке перемешивали потоком азота (г) при комнатной температуре 2 минутыдля удаления пузырьков CO2 и увеличения скорости разделения фаз. Послепроведения экстракции органическую фазу подавали в проточную ячейкудетектора (5). Оптическую плотность измеряли в условиях остановленногопотока в течение 20 секунд при длине волны 345 нм, затем растворынаправляли на сброс (з). После этого коммуникации системы промывалисьэтанолом (и).
Измерение сигнала холостой пробы проводили при заполнениикюветы проточного детектора хлористым метиленом.Было обнаружено (Рисунок 35А), что скорость потока 1,5 мл/минобеспечивает эффективную экстракцию и одновременно минимальное значениеСКО. При более высоких скоростях потока диспергирование экстрагентапроисходит невоспроизводимо в результате капельного уноса органическойфазы из смесительной камеры.Также было изучено влияние концентраций растворов CH3COOH иNa2CO3, на величину аналитического сигнала и значение СКО.
Концентрациюрастворов CH3COOH и Na2CO3 варьировали в диапазонах от 0,2 до 2 М и от 0,1до 1 М соответственно. Согласно полученным данным (Рисунок 35Б, 35В)59можно сделать вывод, что концентрации 1 М для CH3COOH и 0,5 М дляNa2CO3 обеспечивают наиболее высокое значение оптической плотности инизкоезначениеСКО,которыеибыливыбраныдлядальнейшихэкспериментов.Рисунок 35. Влияние скорости потока (А), концентраций CH3COOH (Б) иNa2CO3 (В) на оптическую плотность экстракта.60Выбранные оптимальные условия легли в основу методики проточногоопределения антипирина в слюне, согласно которой в смесительную камеру(Рисунок 33) подавали 1 мл пробы (а), 1 мл 0,2 М H2SO4 (б) и 1 мл 6 мМ NaNO3(в). Раствор перемешивали потоком азота (г) при комнатной температуре 3минуты.
На следующем этапе с помощью мультишприцевого насоса (оснащенкраном переключателем) в смесительную камеру со скоростью потока 1,5мл/мин подавали одновременно 300 мкл 0,5 М Na2CO3 (д), 300 мкл 1 МСН3СООН (е), 300 мкл хлористого метилена (ж). После завершенияобразования СО2 в смесительной камере, с помощью которого осуществляетсядиспергирование экстракта, растворы перемешивали потоком азота (д) 2минуты для удаления оставшихся пузырьков CO2 и увеличения скоростиразделения фаз. После разделения фаз органическую фазу подавали впроточную ячейку детектора. Оптическую плотность измеряли в условияхостановленного потока в течение 20 с при длине волны 345 нм (Аn), затемрастворы направляли на сброс (з).
После этого коммуникации системыпромывались этанолом (и). Измерение сигнала холостой пробы проводили призаполнении кюветы проточного детектора хлористым метиленом (А0). Значениеаналитического сигнала соответствовало разнице между значениями Аn и А0.При проведении анализов для построения градуировочного графика повышеописанной схеме вместо пробы слюны подавали стандартные растворыантипирина с концентрациями 1,5 – 100 мкМ. Полученный градуировочныйграфик (Рисунок 36) линеен в диапазоне от 1,5 до 100 мкM антипирина.
Пределобнаружения, вычисленный по критерию 3σ – 0,5 мкM антипирина.Воспроизводимость результатов анализа, вычисленная как среднеквадратичноеотклонение результатов анализа, установленная для крайних значенийдиапазона определяемых концентраций (1,5 и 100 мкM) составила 4,0 % и 5,0 %соответственно.61Рисунок 36. Градуировочный график для определения антипирина в слюнеметодом ЦИА с микроэкстракционным выделением с диспергированиемэкстрагента газовой фазой (0,2 М раствор H2SO4, 6 мМ раствор NaNO2, 1Мраствор CH3COOH, 0,5 М раствор Na2CO3).Было исследовано влияние схожих по структуре метаболитов антипирина– норантипирина и 4-гидроксиантипирина. Основными путями превращенияантипирина под действием микросомальных оксидаз гепатоцитов является Сгидроксилирование в позицию 4,3-метил и N-деалкилирование.
Образующиесяметаболиты: 4-гидроксиантипирин, 3-гидроксиметилантиприн, норантипирин,3-карбоксиантипирин и 4,4’-дигидроксиантипирин [131].Кроме этого было изучено влияние основных компонентов слюны (K+,Na+, Ca2+, Cl-, PO43-, SCN-, НСО3-, (NH2)2CO [130]) на его циклическоеинжекционное спектрофотометрическое определение с МЭДЭ.Для этого в слюну, содержащую антипирин, вводили добавки известнойконцентрации ионов K+, Na+, Ca2+, Cl-, PO43-, SCN-, НСО3-, (NH2)2CO,норантипирина и 4-гидроксиантипирина.Допустимые концентрации, при которых отличие сигнала от исходногозначения составляет не более 5%, представлены в таблице 3.62Таблица 3Влияние мешающих веществ на определение антипирина в слюне (100мкМ раствор антипирина, 0,2 М раствор H2SO4, 6 мМ раствор NaNO2).K+Допустимаяконцентрация, мM50Cодержание в слюне,мМ [130]20Na+5020-80Ca2+2001-4Cl->500100PO43-1004SCN-1002HCO3-10015-80(NH2)2CO>5002-4норантипирин15019 [131]4-гидроксиантипирин10040 [131]Примесный компонентАнализ приготовленных образцов показал, что мешающее влияние небыло обнаружено для концентраций, реально присутствующих в слюне.Следует отметить, что по данным ВЭЖХ/МС анализа на полученныххроматограммах отсутствуют пики метаболитов (Рисунок 37А), поскольку онинаходятся в связанном состоянии с белками слюны и не извлекаются ворганическуюфазувпроцессеЖМЭ.Нарисунке37Бприведенахроматограмма смешанного раствора антипирина и его метаболитов.Для проверки правильности разработанных методик ЦИА проводилиопределение антипирина в слюне добровольцев (студентов и аспирантовИнститута химии СПбГУ) после однократного per os приема таблеткиантипирина (600 мг, ОАО «Татхимфармпрепараты», экспериментальнаялекарственная форма).
Максимум содержания антипирина в слюне наблюдалсячерез 6 часов после приема препарата.Рисунок 37. Хроматограмма смешанного раствора антипирина и его метаболитов и их масс-спектры.ДляподтвержденияпараллельнопроводилиправильностианализприразработанныхпомощиметодикизвестнойЦИАметодикивысокоэффективной жидкостной хроматографии [132].Пример полученной хроматограммы представлен на рисунке 38.AntipyrinemAU243nm4nm (1.00)40.037.535.032.530.027.525.022.520.017.515.012.510.07.55.02.50.00.0Рисунок38.2.5Хроматограмма,5.07.5полученнаяminдляобразцаслюны(концентрация антипирина – 100 мкМ) при выбранных хроматографическихусловиях определения.Результаты определения антипирина в пробах слюны, полученные спомощью разработанных методик и ВЭЖХ были сравнены с помощью F- и tтестов и представлены в таблице 4.
Полученные F-значения ≤ 6,4 указывают нанезначительное различие в величинах стандартных отклонений, а полученныеt-значения ≤ 2,78 указывают на то, что нет статистически значимого различиямежду результатами, полученными при помощи методик ЦИА и ВЭЖХ.65Таблица 4Результаты определения антипирина в пробах слюны (n = 5, P = 0,95, Fкр =6,4, tкр = 2,78).Найдено антипирина вслюне, мкММетод пробоподготовкиF-значение t-значениеЦИАВЭЖХПробаДериватизация,микроэкстракция сдиспергированиемэкстрагента полярнымрастворителемДериватизация,микроэкстракция сдиспергированиемэкстрагента газовойфазой1231234,1±0,14,0±0,12,12,223±123,0±0,54,21,750±251±13,12,786±389±24,72,476±376±22,32,819,1±0,820,0±0,52,11,5Сравнение аналитических характеристик разработанных методик ЦИА смикроэкстракционным выделением с диспергированием экстрагента полярнымрастворителем (ацетонитрил) и газовой фазой, образующейся in situ,представлено в таблице 5.Таблица 5Сравнениеаналитическиххарактеристикметодикциклическогоинжекционного спектрофотометрического определения антипирина в слюне.ХарактеристикаДиспергаторАцетонитрилУглекислый газ3-2001,5-2000,9980,999ПО, мкМ10,5СКО (n = 10), %55Время анализа, мин1210Диапазон определяемыхконцентраций, мкМКоэффициент корреляции, r266Различие в пределах обнаружения антипирина обусловлено тем, что придиспергировании экстрагента газовой фазой удалось снизить оптическуюплотность холостой пробы более чем в 2 раза.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
