Диссертация (1150273), страница 12
Текст из файла (страница 12)
Предложенная схема анализа можетбыть реализована при определении и других аналитов в биологическихжидкостях,способныхизвлекатьсявлегколетучиехлорорганическиерастворители. Следует отметить, что впервые разработана проточная методикаопределения кофеина в слюне. Аналитические характеристики разработаннойметодики представлены в таблице 10. Методика обеспечивает полнуюавтоматизацию анализа с низким расходом пробы и растворов реагентов.83Таблица 10Аналитическиехарактеристикиметодикициклическогоинжекционногопотенциометрического определения кофеина в слюне.Диапазон определяемыхконцентраций, МПредел обнаружения, МКоэффициент корреляции, r2СКО (n = 5), %Объем пробы, млОбъем 0,01 М H2SO4, млОбъем экстрагента, мклВремя анализа, мин10-5 – 10-38·10-70,9985,00,30,3110Сравнение аналитических характеристик разработанной методики сизвестными методиками определения кофеина в биологических жидкостяхпредставлено в таблице 11.
Наибольшее распространение получили методыВЭЖХ и спектрофотометрические методы. Из этих данных можно сделатьвывод, что разработанная методика не уступает по пределам обнаружениясуществующим. Основное отличие методики на принципах ЦИА состоит вавтоматизации анализа и повышении экспрессности анализа.Таблица 11Аналитические характеристики методик определения кофеина в биологических жидкостях.МетодопределенияВЭЖХАвтоматизированаДиапазонопределяемыхконцентраций, мг/лПО, мг/лСсылкаМочаНет3,2-71-[149]МеконийНет0,01-0,250,01[150]ГрудноемолокоНет-1,6[151]ПробоподготовкаАнализируемыйобъектФильтрацияВЭЖХ/МСТвердофазнаяэкстракцияЖидкостнаямикроэкстракцияВАНетМочаНет0,004-191,6·10-3[152]ЦВАНетКровьНет4,8-390,1[153]ВЭЖХ84АвтоматизированаДиапазонопределяемыхконцентраций, мг/лПО, мг/лСсылкаНет0,06-120,02[154]Нет-0,4[155]КровьНет1,5-1941,5[156]ТвердофазнаяэкстракцияМочаНет-2[157]КМЭСлюнаДа1,5-1000,5[158]МетодопределенияПробоподготовкаЦВАФильтрацияМЭКХФильтрацияМЭКХФильтрацияКЭ-МСЦИААнализируемыйобъектМоча,кровьМоча,кровьВЭЖХ – высокоэффективная жидкостная хроматография, ВЭЖХ-МС –высокоэффективная жидкостная хроматография с масс-спектрометрией, ВА –вольтамперометрия, КЭ-МС – капиллярный электрофорез с масс-спектрометрией,ЦВА – циклическая вольтамперометрия, МЭКХ - мицеллярная электрокинетическаякапиллярная хроматография, ЦИА – циклический инжекционный анализ.Разработанныйпробоподготовкикомплексныйбиологическихподходкжидкостей,автоматизациинапринципахстадийкапельноймикроэкстракции и циклического инжекционного анализа, позволил проводитьавтоматизированный анализ с максимальной чувствительностью, характернойдля проточных методов с принудительной конвекцией.
Следует еще разподчеркнуть, что метод ЦИА позволяет производить замену растворителя, чтоможетбытьиспользованодляэлектрохимических методов и др.другихметодованализа–ВЭЖХ,85Глава 5. Комбинированный проточный метод, основанный на сочетаниициклическогоинжекционногоанализаиметодакомбинированныхградуировокЖидкостная микроэкстракция практически непригодна для выделенияаналитических форм, обладающих преимущественной растворимостью вводной фазе.
В этом случае используют альтернативные методы разделения иконцентрирования или другие подходы, которые позволяют учесть мешающеевлияние матрицы пробы. Одним из таких подходов является методкомбинированных градуировок, представляющий собой комбинацию методаградуировочного графика и метода стандартных добавок, обеспечивающийвозможностьоптимизациипроцедурыразбавленияon-lineпробыдляустранения влияния матричных эффектов.В данной работе была изучена возможность реализации МКГ напринципах ЦИА. Для этого в шести однотипных смесительных камерах(Рисунок 50) осуществляется разбавление пробы, проведение аналитическойреакции,добавлениестандартногорастворааналитавопределенномсоотношении для построения градуировочных зависимостей при даннойстепениразбавленияпробы.Всмесительныекамеры,спомощьюперистальтического насоса через однотипные краны-переключатели, подаютсяпорции пробы, реагентов, разбавителя и стандартного раствора.
Послеперемешивания растворов в смесительных камерах газовой фазой, онинаправляются последовательно в детектор.В качестве аналита для подтверждения возможностей метода был выбранизониазид (гидразид изоникотиновой кислоты).86Рисунок 50. Схема ЦИА для реализации метода комбинированныхградуировок. СКN – смесительная камера.В настоящее время для эффективного лечения туберкулеза используютсякомплексные препараты в состав которых входит изониазид, рифампицин,этамбутол и пиразинамид.
Однако высокие концентрации изониазида ворганизме человека могут приводить к таким нежелательным последствиям,как поражение печени, эпилепсия или даже к смерти [159, 160]. Кроме этого,следует отметить, что скорость метаболизма изониазида в организме человеказависит от многих особенностей организма [161-163]. Пациенты могут бытьразделены на «быстрых инактиваторов» (выделение менее 10% исходноговещества с мочой в течение суток) и «медленных инактиваторов» (выделениеболее 10% изонаизида) в зависимости от скорости, с которой происходитпревращение изониазида в токсичные метаболиты. Его метаболизм происходитв гепатоцитах: ацетилирование N-ацетилтрансферазой до фармакологическинеактивногоN-ацетилизониазида,которыйзатемпревращаетсявизоникотиновую кислоту и моноацетилгидразин (оказывает гепатотоксичноедействие). Таким образом, важной задачей клинической диагностики являетсяоптимизация режимов дозирования изониазида в зависимости от особенностейпациентов.87Для спектрофотометрического определения в моче изониазид определялипо реакции образования окрашенного комплекса с метаванадатом аммония(МВА)[164].Подробноеисследованиереакциикомплексообразованияизониазида с МВА в зависимости от кислотности среды, наличия компонентовреакционной смеси и времени дериватизации было проведено в работе [165].Образование комплекса происходит мгновенно, однако, наблюдается и егобыстрое разрушение (Рисунок 51).Неустойчивость аналитических формограничивает возможность их применения в ЦИА при реализации МКГ, так какс целью сокращения времени анализа образование аналитических форм всмесительных камерах должно происходить одновременно с последующим ихпоследовательным фотометрированием.В работе быловыявлено, чтодобавление цитрат-ионов повышает устойчивость аналитической формы(Рисунок 51).
При этом происходит образование смешанного окрашенногокомплекса изониазида с метаванадат- и цитрат-ионами.Предварительно было установлено, что комплекс не извлекается ворганические растворители (хлорорганические экстрагенты). Кроме того, быловыявлено, что добавление цитрат-ионов повышает устойчивость этогокомплекса и уменьшает скорость его разложения, что особенно важно припроведениимультикоммутационногоЦИА,посколькупроисходитодновременное протекание аналитических реакций в нескольких смесительныхкамерахприпоследовательномизмеренииоптическихплотностейобразовавшихся аналитических форм.Для проведения анализа в смесительную камеру (СК1) (Рисунок 50) спомощью перистальтического насоса вводили по 125 мкл 100 мкМ раствораизониазида, 0,1 М цитратного буферного раствора (1) и 0,6 мМ МВА, растворыво всех смесительных камерах последовательно перемешиваются в течение 10 своздухом.
Затем раствор из СК1 направляется в кювету оптоволоконногоспектрофотометрического детектора для измерения оптической плотности (А1)в режиме остановленного потока при 420 нм.88Рисунок51.Влияниецитрат-ионовнаустойчивостькомплексаметаванадат-ионов с изониазидом (изониазид 100 мкМ, МВА 0,6 мМ, рН 2,2).Поскольку МВА и моча являются окрашенными растворами, былонеобходимо убедиться в отсутствии перекрывания спектров поглощения.
Дляэтого были сняты спектры МВА, комплекса МВА и изониазида и комплекса,образованного в присутствии цитрат-ионов (Рисунок 52). Из полученныхданных видно, что перекрывание спектров незначительно и может быть учтенопри добавлении МВА в холостую пробу.Рисунок 52. Спектры поглощения: 1 – комплекс изониазида с МВА ицитрат-ионами, 2 – комплекс изониазида с метаванадат-ионами, 3 – растворМВА (изониазид 100 мкМ, МВА 0,6 мМ, рН 2,2).89Затемдляоптимизацииусловийциклическогоинжекционногоспектрофотометрического определения изониазида в моче было изученовлияние кислотности среды, концентрации цитрат-ионов и МВА по схеме,описанной выше.Рисунок 53.
Влияние рН (А), концентрации цитрат-ионов (Б) иконцентрации МВА (В) на оптическую плотность комплекса 100 мкМизониазида с МВА и цитрат-ионами.Исходя из полученных данных, комплекс стабилен в диапазоне pH от 2,05до 2,25 (Рисунок 53А), для дальнейших экспериментов был выбран рН 2,2. Придобавлениицитрат-ионоввовремякомплексообразованияпроисходитувеличение оптической плотности раствора вплоть до концентрации 0,1 М(Рисунок 53Б), которая и была выбрана в качестве оптимальной. Концентрация90МВА 0,6 мМ является достаточной для эффективного протекания реакциикомплексообразования с изониазидом (Рисунок 53В).Выбранные оптимальные условия легли в основу методики проточногоспектрофотометрического определения изониазида в моче.
Для этого (Рисунок50) с помощью перистальтического насоса и крана 2 разбавитель (5),стандартный раствор изониазида 10 мкМ (4) и проба мочи (1) направляются всмесительные камеры СК1-СК6 в заданных пропорциях (таблица 12), общийобъем растворов составил 1,25 мл. Затем во все реакционные ёмкости спомощью перистальтического насоса вводят по 125 мкл 0,1 М цитратногобуферного раствора (3) и 0,6 мМ раствора МВА (2), растворы во всехсмесительных камерах последовательно перемешиваются в течение 10 своздухом. Затем раствор из СК1 направляется в кювету оптоволоконногоспектрофотометрического детектора для измерения оптической плотности (А1)в режиме остановленного потока при 420 нм.
Измерение аналитическогосигнала повторяется для оставшихся смесительных камер (Аn), затемпроисходит промывка всех коммуникаций системы дистиллированной водой.Измерение сигнала холостой пробы проводили при заполнении кюветыпроточного детектора раствором МВА (А0). Значение аналитического сигналасоответствовало разнице между значениями Аn и А0.По результатам измерений от каждой серии были получены значенияоптических плотностей A1 - A6, которые позволяют рассчитать 6 концентрацийпробы по формулам, представленным в таблице 12.Варьируя степень разбавления пробы, можно найти то значение, прикотором мешающее влияние матрицы пробы будет полностью нивелировано,что приведет к близким значениям концентраций С1 – С6.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
