Диссертация (1150273), страница 7
Текст из файла (страница 7)
Средства измерений и оборудование1. Спектрофотометр «UVmini–1240» (Shimadzu, Япония), спектральныйдиапазон от 190 до 1100 нм.2. Оптоволоконный спектрофотометр «USB 4000», (Ocean Optics, США),источник видимого света «LS-1», проточная кювета «FIA-Z-SMA-50-TEF»,(FIAlab®, США) с длиной оптического пути – 50 мм.3. Иономер «И-510» (Аквилон, Россия).4. Жидкостный хроматограф LC-30 Nexera (Shimadzu, Япония) с диодноматричным детектором.5. Система ВЭЖХ (Agilent 1260) с детектором на диодной матрице и скомбинированнымквадруполь-времяпролётныммасс-спектрометромсверхвысокого разрешения с ионизацией электроспреем (ESI-QTOF) серияmaXis (Bruker, Daltonik).6.
Электронные весы «Pioneer PA-214C» (Ohaus, США), 2-ой класс точности,предел взвешивания 210 г, дискретность 0,1 мг.7. Шестиходовой соленоидный кран-переключатель (Cole- armer, США).8. Колбы мерные (ГОСТ 1770-74).9. Кофеин-селективный мембранный электрод (изготовлен на кафедрерадиохимии Института химии СПбГУ) в качестве рабочего электрода. Сенсорбыл изготовлен на основе мембраны из пластифицированного ПВХ,содержащей33нитрофениловоговесовыхэфирапроцентаполимера,(пластификатора)и65%2%2-фторфенил-2тетракис[3,5-бис(трифторметил)фенил]борат калия в качестве электроактивного компонента.10.
Хлорсеребряный электрод сравнения ЭВЛ 1М 3.1 (Гомель, Белоруссия).11. Перистальтический насос «MasterFlex L/STM» (Cole - Parmer, США)(скорость потока от 0,5 до 6 мл/мин).12. Шприцевой насос (Crison, Испания).13. Циркуляционный термостат (LOIP, Россия).4114. Центрифуга (SIGMA 2-6, 4000 об/мин, Германия).15. Шприц хроматографический вместимостью 10 мкл.16. Ультразвуковая ванна «УЗВ-1,3» (Сапфир, Россия). Температурныйдиапазон от +15 °С до +70 °С. Точность поддержания температуры ±1 °С.2.2.
Реактивы и приготовление растворовВсе используемые в работе реактивы имели квалификацию не ниже ч.д.а.Приготовление растворовВ химический стакан помещали навеску аналита согласно таблице 1,добавляли 10 мл дистиллированной воды и перемешивали смесь до полногорастворения аналита. Раствор количественно переносили в мерную колбувместимостью100мл,промывалистаканчиктремяпорциямидистиллированной воды по 10 мл, доводили объём раствора в колбе до меткидистиллированной водой и тщательно перемешивали. Рабочие растворывеществ готовили путём последовательного разбавления исходного раствора.Таблица 1Массы аналитов.ВеществоПроизводительМассанавески, мгКонцентрация, МАнтипирин18,8010-3Норантипирин17,4010-34-гидроксианипирин20,4010-3Кофеин188010-1ТеофиллинИмп., Sigma-180,010-2ТеоброминAldrich180,010-2Параксантин180,010-2Изониазид137010-1Рифампицин823,010-2Пиразинамид123,010-242Приготовление метаванадата аммония 10 мМНа аналитических весах брали навеску метаванадата аммония массой0,2925 г.
Далее её количественно переносили в мерную колбу вместимостью250 мл путем растворения в 0,1 М серной кислоте. Раствор оставляли на 30минут в ультразвуковой ванне для более полного растворения соли. Затемполученный раствор фильтровали.Приготовление цитратного буферного раствора (рН=2,2)Навеску 10,5 г лимонной кислоты из стаканчика для взвешиванияколичественно переносили в мерную колбу вместимостью 1 л, промывалистаканчик не менее пяти раз по 20 мл дистиллированной воды, сливаяпромывные воды в ту же колбу, и добавляли 200 мл 0,5 М раствора гидроксиданатрия. Объем раствора в колбе доводили до метки дистиллированной водой итщательно перемешивали.
Для достижения требуемого рН добавляли по каплям0,5Мрастворсернойкислотыприперемешивании.рНраствораконтролировали с помощью рН-метра.Приготовление подвижной фазы для ВЭЖХ/МСЭлюирование осуществляли в градиентном режиме. Подвижная фазасостояла из 10 мМ водного раствора триэтиламина и ацетонитрила. Программаградиента представлена в таблице 2.
Скорость подвижной фазы составила 0,3мл/мин.Таблица 2Программа градиентного режима для ВЭЖХ-МСT, мин % A (10 ммол L-1 триэтиламина) % B (ацетонитрил)0307057030770308802043Лекарственные препараты, использованные в работе1.«Антипирин»лекарственнаяформа),(«Татхимфармпрепараты»,таблетки,содержащие600экспериментальнаямгантипирина.Вспомогательные вещества: крахмал картофельный, кальция стеарат.2. «Изониазид» (ОАО «Мосхимфармпрепараты» им. Н.А. Семашко),таблетки, содержащие 300 мг изониазида. Вспомогательные вещества: кальциястеарата моногидрат – 3,3 мг, полисорбат-80 – 0,5 мг, кросповидон (коллидонCL-М) – 3,3 мг, крахмал картофельный – достаточное количество.3.
«Кофеин – бензоат натрия» («Татхимфармпрепараты»), таблетки,содержащие100мгкофеина.Вспомогательныевещества:крахмалкартофельный – 15,77 мг, кальция стеарат – 0,23 мг.2.3. Пробоотбор и пробоподготовка биологических жидкостейПробоотбор слюныПосле предварительного ополаскивания полости рта дистиллированнойводой, слюну собирали в полипропиленовые стакан до метки (4 мл).
2 млотобранной слюны помещали в пробирку для центрифугирования и добавляли3 мл воды для уменьшения вязкости. Полученные растворы центрифугировалив течение 5 мин при 5000 об/мин с целью осаждения твердых компонентовслюны. После этого 1 мл супернатанта переносили в эппендорф дляпоследующего анализа.Пробоотбор мочиМочу собирали в полипропиленовые стаканы до метки (10 мл) ипередавали на анализ.44Глава 3.
Циклический инжекционный анализ биологических жидкостей,включающий дериватизацию и микроэкстракцию с диспергированиемэкстрагентаНа сегодняшний день в аналитической химии для экспрессного иавтоматизированного анализа биомедицинских объектов широкое применениенаходят проточные методы, основными преимуществами которых являютсяминимизация трудовых затрат, радикальное сокращение расходов проб,реагентов и образующихся отходов, простота инструментального исполнения,высокая производительность и прецизионность. Однако существуют проблемы,ограничивающие возможности известных проточных методов в анализе такихобъектов – низкая селективность и недостаточная чувствительность.
Этипроблемы могут быть устранены с помощью новых эффективных методовразделения и концентрирования в условиях проточного анализа.Одним из таких широко используемых методов является ЖМЭ, котораяобеспечиваетвысокиекоэффициентыконцентрированияивысокуюселективность. Как было показано в обзоре литературы, МЭДЭ являетсяэффективным методом разделения и концентрирования и широко используетсяв аналитической химии. Метод основан на диспергировании экстрагента висходной жидкой пробе с помощью диспергатора, в качестве которого можетвыступать или полярный растворитель, или газовая фаза.
В первом случаедиспергатор должен неограниченно смешиваться как с экстрагентом, так и cводной фазой с целью образования тонкодисперсной эмульсии органическойфазы и, следовательно, большей площади контакта фаз и высокой скоростимассообмена. Во втором случае газовая фаза образуется в растворе пробы врезультате химической реакции и диспергирование органической фазыосуществляется микропузырьками газа.45Для решения проблемы автоматизации МЭДЭ в рамках данной работыизучалась возможность применения циклического инжекционного анализа(ЦИА).ЦИА является проточным методом с принудительной конвекцией иобеспечивает максимальную чувствительность анализа по сравнению сдиффузно-конвективными проточными методами [123-125], поскольку в ЦИАотсутствует дисперсия зон проб в гидравлических трассах, а такжеобеспечивается возможность полного протекания аналитических реакций илидериватизации.Концепция ЦИА предполагает выполнение последовательности стадийанализа,характерныхпробоподготовку,длявключающуюстационарных(приметодик:необходимости)отборпробы;концентрированиеаналитов или дериватизацию; добавление к раствору пробы растворовреагентов; перемешивание растворов потоком инертного по отношению ккомпонентам реакционной смеси газа до установления равновесия в системе;термостатирование (при необходимости); паузу для достижения максимальногозначенияаналитическогосигнала(принеобходимости)иизмерениеаналитического сигнала [126].В свою очередь, применение дериватизации при анализе биологическихжидкостей широко используется для получения производных, позволяющихобеспечить возможность их селективного и чувствительного определения.Методы проточного анализа с принудительной конвекцией обеспечиваютдериватизацию при эффективном перемешивании реакционных смесей вспециальных смесительных камерах.Для автоматизации дериватизации с последующей микроэкстракцией придиспергировании экстрагента полярным растворителем была разработана новаяинструментальная схема пробоподготовки на принципах ЦИА (Рисунок 25).Всоответствиисэтойсхемойпоследовательноосуществляютсяпроцедуры дериватизации и микроэкстракции с помощью двух однотипных46кранов-переключателей и перистальтического (для подачи водных сред) ишприцевого (для подачи органических жидкостей) насосов.Рисунок 25.
Схема ЦИА, включающая дериватизацию и микроэкстракциюпри диспергировании экстрагента полярным растворителем.Для автоматизации процесса дериватизации и микроэкстракции в условияхпроточного анализа и одновременного измерения оптической плотностиэкстракта была разработана специальная смесительная камера (изготовлена вООО «Фторопластовые технологии») (4), представляющая собой монолитнуюячейку. Изготовленная из ПТФЭ камера (высота – 50 мм, внутренний диаметр –10 мм) имеет вертикально расположенный канал, предназначенный дляобразованияаналитическойформывравновесныхусловияхиеёэкстракционного выделения, и перпендикулярно расположенный канал,предназначенный для проведения спектрофотометрических измерений.
Крометого, предполагается наличие дополнительного бокового канала для вводаэкстрагирующей смеси (Рисунок 26).47Рисунок26.Чертежсмесительнойкамерыдляпроведениямикроэкстракции.В камеру с помощью перистальтического и шприцевого насосов черезоднотипные краны-переключатели подаются порции пробы, реагентов и смесиэкстрагента с диспергатором. Во всех случаях перемешивание водныхрастворов осуществляется при подаче газовой фазы в смесительную камеру спомощью перистальтического насоса.Принципиальное отличие разработанной схемы от ранее предложеннойAndruch [91] схемы МЭДЭ на принципах SIA заключается в использованиигазовой фазы для интенсификации процесса разделения фаз за счетагрегатирования частиц микроэмульсий при их перемешивании.Аналитическиевозможностиразработаннойсхемы,включающейдериватизацию и микроэкстракцию с диспергированием экстрагента полярнымрастворителем, были продемонстрированы при определении антипирина(феназон, 2,3-диметил-1-фенил-3-пиразолин-5-он) в слюне.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
