Диссертация (1150273), страница 11
Текст из файла (страница 11)
Затем в виалу добавляли 3 мл раствора 0,01 М H2SO4 (б) длясоздания рН = 2 и перевода кофеина в протонированную форму. После этогораствор переносили в электрохимическую ячейку. Раствор перемешивали втечение 1 минуты для установления значения потенциала электрода. Послеэтого ячейку промывали дистиллированной водой.Было обнаружено, что наиболее эффективным экстрагентом являетсяхлороформ, который обеспечивает максимальное извлечение кофеина приминимальной экстракции метаболитов (Рисунок 44А), таким образом, устраняяих мешающее влияние.Следует отметить, что капли объемом больше 1 мкл были нестабильнымии происходил их отрыв с иглы микрошприца.
Выбранный объем экстрагента 1мклобеспечиваетстабильностькапливходеэкспериментаивоспроизводимость результатов анализа (СКО ≤ 3%).Дляоптимизацииусловиймикроэкстракциикофеинавкаплюхлороформа было изучено время, необходимое для достижения равновесия всистеме: водный раствор пробы – хлороформ (Рисунок 44Б). Было установлено,что для достижения максимальной степени извлечения достаточно 3 мин.76Рисунок 44. Степень извлечения алкалоидов в растворы различныххлорорганических экстрагентов (А); Влияние времени экстракции на степеньизвлечения алкалоидов в каплю хлороформа (Б).
Концентрация алкалоидов 10-4М, рН=2, объем пробы 0,3 мл, объем экстрагента 1 мкл.Кроме того, было изучено влияние объема пробы на степень извлечениякофеина в каплю хлороформа. Объем пробы варьировали от 0,1 до 0,5 мл, приэтом концентрация кофеина в пробе была постоянной и составляла 10 -4 М (рН =2). При увеличении объема пробы происходило увеличение аналитическогосигнала, при объеме пробы 0,3 мл аналитический сигнал достигал своегомаксимального значения и не увеличивалась в дальнейшем (Рисунок 45), чтообусловлено незначительным коэффициентом распределения кофеина ввыбранной системе (Kd = 2).Также были изучены различные способы перемешивания раствора пробы:ультразвук (частота 35 кГц, мощность генератора 50 Вт), барботаж воздуха(скорость потока 5 мл/мин), механическое перемешивание и вибрация (Рисунок46).Использованиедополнительныхсредствдляинтенсификациимассопереноса приводило к отрыву капли и увеличению значения СКО.Для потенциометрического определения кофеина после капельноймикроэкстракции необходимо произвести замену растворителя, посколькухлороформ разрушает мембрану сенсора.
На первом этапе необходимо удалитьэкстрагент. Для этого поток воздуха пропускали через смесительную камеру.77Было отмечено, что при подаче воздуха со скоростью 1 мл/мин в течение 4 мин,происходит полное испарение хлороформа.Степень извлечения, %60504030201000.10.20.3Объём пробы, мл0.40.5Рисунок 45. Влияние объема пробы на степень извлечения кофеина (pH=2,концентрация кофеина 10-4 М, объем экстрагента 1 мкл, время экстракции 3мин).1614СКО, %121086420БезперемешиванияУльтразвукВибрацияБарботажвоздухаМагнитнаямешалкаРисунок 46. Влияние способа перемешивания раствора пробы на степеньизвлечения кофеина в каплю хлороформа.78Влияние объема раствора кислоты, подаваемого в смесительную камеру,на эффективность растворения аналита было изучено при варьированииразличных объемов 0,01 М H2SO4 в диапазоне от 0,1 мл до 0,5 мл.
Для этого(Рисунок 39) 0,3 мл супернатанта слюны (а) отбирали с помощью шприцевогонасоса в удерживающую спираль и далее направляли в смесительную камеру.После этого с помощью микрошприца выдавливали каплю объёмом 1 мклпредварительно отобранного хлороформа в глубине раствора на расстоянии 5мм от поверхности. В течение трёх минут происходил массоперенос кофеина изпробы в каплю экстрагента. После чего пробу сбрасывали, а каплю экстрагентавыдавливали в смесительную камеру, которую затем продували воздухом спомощью шприцевого насоса, при этом происходило испарение хлороформа.Затем в смесительную камеру подавали 0,3 мл раствора 0,01 М H2SO4 (б) длясоздания рН = 2 и перевода кофеина в протонированную форму, а также воздухдля перемешивания раствора. После этого раствор направляли в проточнуюэлектрохимическую ячейку для измерения разности потенциалов.
После этогосистему промывали дистиллированной водой (в).Было установлено (Рисунок 47), что 0,3 мл кислоты являютсяоптимальными, обеспечивая минимальное значение СКО (< 5 %) приминимальном объеме растворителя.Рисунок 47.Зависимость155потенциала электрода150от объёма сернойЕ, мВ145кислоты,140необходимой для135полного растворения130сухого остатка послепроведения капельной1250.10.20.30.40,01 М H2SO4, мл0.5микроэкстракции.79Выбранныеусловиялегливосновуметодикипроточногопотенциометрического определения кофеина в слюне (Рисунок 39). Для этого0,3 мл супернатанта слюны (а) отбирали с помощью шприцевого насоса вудерживающую спираль и далее направляли в смесительную камеру.
Послеэтого с помощью микрошприца выдавливали каплю объёмом 1 мклпредварительно отобранного хлороформа в глубине раствора на расстоянии 5мм от поверхности. В течение трёх минут происходил массоперенос кофеина изпробы в каплю экстрагента. После чего пробу сбрасывали, а каплю экстрагентавыдавливали в смесительную камеру, которую затем продували воздухом спомощью шприцевого насоса, при этом происходило испарение хлороформа.Затем в смесительную камеру подавали 0,3 мл раствора 0,01 М H2SO4 (б) длясоздания рН = 2 и перевода кофеина в протонированную форму, а также воздухдляперемешиванияраствора.Послеэтогорастворнаправляливэлектрохимическую ячейку.
Раствор перемешивали в течение 1 минуты дляустановления значения потенциала электрода. После этого ячейку промывалидистиллированной водой (в).При проведении анализов для построения градуировочного графика повышеописанной схеме вместо пробы слюны подавали стандартные растворыкофеина с концентрациями 10-5 – 10-2 М. Полученный градуировочный график(Рисунок 48) линеен в диапазоне от 10-5 до 10-2 М кофеина. Пределобнаружения – 8·10-7 М кофеина. Предел обнаружения кофеина при указанныхусловиях потенциометрического определения значительно ниже концентрацийэтого вещества реально присутствующего в слюне.
Воспроизводимостьрезультатованализа,вычисленнаярезультатованализа,установленнаякакдлясреднеквадратичноекрайнихзначенийотклонениедиапазонаопределяемых концентраций (10-5 – 10-2 M), составила 4,0 % и 5,0 %,соответственно.80350y = -51.899x + 358.19R² = 0.99300Е, мВ25020015010050022.533.5рС кофеина44.55Рисунок 48. Градуировочный график для определения кофеина в слюнеметодом ЦИА с капельной микроэкстракцией.Для проверки правильности разработанных методик ЦИА проводилиопределение кофеина в слюне добровольцев (студентов и аспирантовИнститута химии СПбГУ) после однократного per os приема таблетки кофеинбензоат натрия (100 мг, ОАО «Татхимфармпрепараты»). В течение 24 часовперед анализом волонтер исключал из своего рациона продукты и напитки,содержащие кофеин.
Максимум содержания кофеина в слюне наблюдался через4 часа после приема препарата. В работах [146-148] было продемонстрированоиспользование кофеина в качестве тест-препарата для анализа слюны у разныхгрупп пациентов.Для подтверждения правильности полученных результатов параллельнопроводили анализ при помощи известной методики ВЭЖХ. Для этого к 1 млсупернатанта добавляли 1 мл хлороформа, смесь встряхивали. Затем длябыстрого разделения фаз образовавшуюся эмульсию центрифугировали при3000 об/мин в течение 2 минут. После этого с помощью шприца отбиралиорганическую фазу и помещали в пробирку. На водяной бане (под током81аргона) выпаривали растворитель, к сухому остатку вводили 0,5 мл воды,раствор отфильтровали через фильтр (SupelCo Iso-disc N-13,4) и 20 мклраствора вводили в петлю хроматографа.ВЭЖХанализвыполнялинажидкостномхроматографеLC-20(«Shimadzu», Япония) c УФ-детектирование при 205 нм (диодная матрица).Хроматографическое разделение осуществлялось на колонке «SUPELCO C18»(250x4,6 мм, размер частиц 5 мкм) в градиентном режиме.
В качестве элюентаА использовали 5 % ацетонитрила с 0,035 % трифторуксусной кислоты вфосфатном буферном растворе (рН = 3.1), В – 50 % ацетонитрила с 0,025 %трифторуксусной кислоты в фосфатном буферном растворе (рН=3.1). Ихсоотношений было 9 : 1. Скорость подачи 1 мл/мин.Пример хроматограммы, полученной для образца слюны, представлен нарисунке 49.Рисунок 49. Хроматограмма, полученная для образца слюны, привыбранных хроматографических условиях определения.82Результаты определения кофеина в слюне представлены в таблице 9.Правильностьполученныхрезультатовразработаннымиметодамиподтверждена методом ВЭЖХ.
Результаты были сравнены с помощью F- и tтестов. Полученные F-значения ≤ 6,4 указывают на незначительное различие ввеличинах стандартных отклонений, а полученные t-значения ≤ 2,78 указываютна то, что нет статистически значимого различия между результатами,полученными при помощи методик ЦИА и ВЭЖХ.Таблица 9Результаты определения кофеина в пробах слюны(n = 5, P = 0,95, Fкр = 6,4, tкр = 2,78).Найдено кофеина в слюне,10-4 МПробаF-значениеЦИАВЭЖХ119,1±0,419,2±0,52,3216,0±0,416,6±0,43,8329,2±0,728,0±0,72,7t-значение1,81,71,1Отсутствие селективности потенциометрического определения кофеина вслюне было эффективно компенсировано использованием метода капельноймикроэкстракции и заменой растворителя.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
