Диссертация (1150176), страница 3
Текст из файла (страница 3)
Гидрофобные взаимодействия такжеослабляются, так как молекула денатуранта вытесняет воду из сольватной оболочкимакромолекулы [65]. Концепция косвенного механизма состоит в том, что денатурантвоздействует на свойства растворителя, упорядочивает или разрыхляет сеткуводородных связей, изменение которых в свою очередь приводит к денатурации [66].Наиболее часто в качестве денатурирующих агентов используются гидрохлоридгуанидина (ГХГ) и мочевина [67].
ГХГ оказывается более сильным денатурантом, чеммочевина. Он способен вызывать разворачивание белковых глобул при концентрациях в2-2,5 раза меньших, чем мочевина и сильнее снижать биологическую активность белков[68]. Возможно, что это связано с ионной природой ГХГ и его способностьюдиссоциировать в растворе. Это предположение подтверждается тем, что приувеличении ионной силы раствора мочевина проявляет такую же эффективность, какГХГ [69].Танфорд показал, что когда белок разворачивается, многие неполярныеаминокислотные остатки, находившиеся внутри гидрофобного ядра, начинаютконтактировать с растворителем [70].
Изменение свободной энергии Гиббса (∆G)перехода оказывается отрицательным, как для мочевины, так и для гидрохлоридагуанидина. Взаимодействие денатурантов с глобулой сопровождается уменьшением какэнтальпии, так и энтропии, однако больший вклад вносит энтальпийная составляющая[17].Экспериментальные [66,71,72] и теоретические [73–76] исследования позволилиопределить некоторые детали взаимодействия мочевины с водой и с аминокислотнымиостатками. Метод рассеяния нейтронов показал, что мочевина встраивается в структуруводы за счет образования водородных связей [66]. Каждая молекула мочевины образуетв среднем примерно 5,7 водородных связей.
Более того, мочевина способна также13образовывать водородные связи сама с собой, образуя цепочки и кластеры в растворе. Вто же время оказалось, что ион гуанидина не имеет заметной гидратной оболочки [77]. Врастворе этот денатурант существует преимущественно в виде димеров, вокруг которыхупорядоченно расположены молекулы воды и противоионы хлора [78].Часть молекул денатуранта связана непосредственно с глобулой с помощьюводородных связей [79,80]. При этом непосредственное взаимодействие молекулмочевины с глобулой происходит на заряженных, гидрофильных участках ееповерхности [76]. В отличие от мочевины, ГХГ связывается с неполярными участкамиповерхности глобулы, образованными остатками триптофана, тирозина и фенилаланиназа счет гидрофобных взаимодейтвий [78]. Одновременно, ГХГ образует водородныесвязи с водой и полярными функциональными группами белка, снижая способностьглобулы к самосборке и увеличивая склонность к гидратации полипептидной цепи.Общие закономерности действия ГХГ и мочевины, рассмотренные выше, можнопроследить на примере растворов смесей денатуранта с лизоцимом.
Лизоцимотносительно устойчив и подвержен химической денатурации в меньшей степени, чемдругие типичные глобулярные белки, например, БСА. При действии на лизоцим, ГХГснижает его ферментативную активность на 40 %, в то время как мочевина только на15% [68].Данные кристаллографических исследований показывают, что даже при оченьвысоких концетрациях мочевины (до 9М включительно), лизоцим не претерпеваетзаметных конформационных изменений, небольшие изменения затрагивают тольколабильные участки на поверхности глобулы [79].
При этом денатурация не затрагиваетα-спирали и β-листы [81].В случае ГХГ меняется, как третичная, так и вторичная структура лизоцима.Вероятно, это отличие от действия мочевины связано с другим типом функциональныхгрупп на поверхности глобулы, с которыми взаимодействует денатурант.В [17,68,79] было показано, что денатуранты взаимодействуют непосредственно сактивными центрами белковой молекулы. Прямой механизм действия ГХГ и мочевинына лизоцим подтверждается методами молекулярной динамики Данный процесссопровождается образованием новых водородных связей.
Для прикрепления молекулы14мочевины требуется образование 2 водородных связей, для ГХГ образование 4-5водородных связей [17].По сравнению с другими белками воздействие гидрохлорида гуанидина нализоцим оказывается более слабым. Заметные признаки разворачивания появляютсятолько при концентрации денатуранта свыше 3 М [82], в то время как дляразворачивания других белков достаточно 1-1,5 М. Возможно, что относительно слабоедействие денатурантов на лизоцим можно связать с особым расположениемдисульфидных мостиков в данном белке. В денатурированном состоянии молекулализоцима занимает относительно малый объем при условии, что дисульфидные связи неразрушены [83].
В результате возникают многочисленные контакты между частямиразвернутой полипептидной цепи, и число молекул воды вблизи гидрофобных группбелка уменьшается [84].Третичная структура фибриногена также далека от состояния статистическогоклубка из-за наличия большого числа дисульфидных мостиков [85]. Объем молекулыбелка увеличивается под действием денатурантов примерно в два раза, однако,геометриямолекулывцеломсохраняется[86].Заметноеослаблениевнутримолекулярных связей наблюдается при концентрациях мочевины выше 3М и ГХГвыше 1 М.
При меньших концентрациях денатурантов отмечается агрегация молекулфибриногена[87].Максимальнаястепеньразворачиваниядостигаетсяприконцентрации мочевины 10 М, а ГХГ 4,5 М. Оба денатуранта оказывают влияние навторичную структуру фибриногена. В нативном состоянии доля спиральных участков вмолекуле составляет около 30-35%. При добавлении 5 М мочевины доля α-спиралейуменьшается до 20%.
В 5 М растворе ГХГ спиральные участки полностью пропадают.Отметим, что денатурация фибриногена в растворах мочевины была обратимой приконцентрациях денатуранта меньше 4 М [88].Действие денатурантов на белки с выраженной мультидоменной структуройможно проследить, анализируя спектры флюоресценции при введении флуоресцентныхметок и специфических лигандов [82,89–91]. Такие исследования были проведены длярастворов БСА, глобула которого состоит из трех слабосвязанных доменов [52]. В рядеработ было показано, что денатурация протекает последовательно [82,89,90,92]. Однаковыводы разных авторов о том, какой из доменов подвергается разворачиванию первым и15какая концентрация денатуранта требуется для начала той или иной стадии процессаоказываются противоречивыми [82,89,90]. Слабые структурные изменения поддействием мочевины начинаются при концентрациях свыше 2 - 3 М [93–96] изавершаются при концентрации 8 М. Молекула БСА переходит в состояние близкое ксостоянию статистического клубка [93,96].
На основании анализа зависимостейразличных структурных параметров от концентрации денатуранта, ряд авторовпредполагают, что разворачивание под действием мочевины протекает с образованиеминтермедиата, в то время как денатурация под действием ГХГ протекает одностадийно[97].
С помощью малоуглового рассеяния нейтронов было показано, что под действиеммочевины меняется геометрия макромолекулы, ее форма удлиняется [94,98], как этопроисходит в кислой среде [53]. В работе [19] подчеркивается особая роль водородныхсвязей и ван-дер-ваальсовых взаимодействий в системе БСА/мочевина. По мнениюавторов, денатурант связывается непосредственно с поверхностью глобулы и движущейсилой процесса разворачивания оказываются оба типа взаимодействий [19].Ионогенные ПАВ также оказывают денатурирующее действие на белки [21,24,99–107].
Для изучения взаимодействия белков с ПАВ чаще всего используют растворы,содержащие додецилсульфат натрия (ДСН). Анализ изотерм связывания БСА/ДСНпозволил выделить три различных механизма связывания [24]. В области малыхконцентрацийПАВвзаимодействиепротекаетпомеханизмуспецифическогосвязывания, в соответствии с которым малое количество отдельных молекул ПАВсвязываются с белком за счет электростатических и стабилизирующих их гидрофобныхвзаимодействий [22,108]. С увеличением концентрации ПАВ, присоединение начинаетосуществляться по механизму некооперативного связывания за счет гидрофобныхвзаимодействий.
По достижении концентрации 3*10-3 М, наблюдается резкоеувеличение количества связанного ПАВ по кооперативному механизму. Дальнейшийрост концентрации ПАВ приводит к насыщению молекулы БСА молекулами ДСН исосуществованию комплексов белок /ПАВ и мицелл в растворе [24,109].Большое число связанных молекул ионогенного ПАВ разрушает системувнутримолекулярных гидрофобных взаимодействий, и приводит к электростатическомуотталкиваниюмеждуучасткамицепи,способствующемуразворачиванию.Совокупность данных различных методов, позволила предложить три различные16модели комплексов, из которых лучше всего согласовалась с экспериментальнымирезультатами для растворов БСА/ДСН модель ожерелья [23,24].
В соответствии с этоймоделью комплекс белок/ПАВ представляет собой несколько мицеллоподобныхагрегатов взаимодействующих с развернутой молекулой белка. Детальная структуратакого комплекса остается предметом дискуссии. Ряд авторов предполагает, чторазвернутая молекула белка оборачивается вокруг одной или нескольких мицелл [21–23,110], другие считают, что агрегаты ПАВ нанизаны на белковую нить, а не обернутыею [24,25,111].Для растворов лизоцим/ДСН при различных рН ниже изоэлектрической точкибыли получены изотермы связывания, аналогичные изотерме для растворов БСА/ДСН иимеющие участки, соответствующие трем механизмам связывания [101]. На участкекривой,отвечающемнекооперативномусвязыванию,образовавшийсякомплексвыпадает в осадок [46,101]. Выпадение осадка происходит вследствие уменьшенияэлектростатического отталкивания между комплексами и гидрофобного взаимодействиямеждунейтральнымичастицами.Придальнейшемувеличенииконцентрациинесвязанного ДСН осадок растворяется.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
