Диссертация (1150176), страница 2
Текст из файла (страница 2)
Адсорбция комплексов белокполиэлектролитрассматриваетсянапримерекомплексовбелковсхлоридомполидиаллилдиметиламмония (ПДАДМАХ) и полистиролсульфонатом натрия (ПСС),отличающихся зарядом и жесткостью цепи.Информация о взаимодействии белков и полиэлектролитов в поверхностном слое,о структуре адсорбционной пленки белок/полиэлектролит должна способствовать6пониманию функционирования белков в живых организмах, а также может бытьиспользована при создании биосенсоров, для развития и оптимизации новых методовдоставки лекарств в живом организме, методов разделения и очистки белков. Изменениевнешних условий и подбор компонентов позволяет широко варьировать не толькофизико-химические свойства таких систем, но и влиять на вторичную и третичнуюструктуры молекулы белка, изменяя ее биологическую активность, что может найтиприменениеприсозданииновыхбиотехнологий.Данныепоповерхностнымреологическим свойствам позволяют найти оптимальные условия для стабилизации пени эмульсий, содержащих белки и используемых в пищевой, косметической ифармацевтической отраслях промышленности.Цель работы состоит в определении механизма формирования адсорбционнойпленки из растворов смеси белок-полиэлектролит на границе раствор - газ и оценкивлияния на этот процесс денатурирующих агентов на основе данных дилатационнойповерхностной реологии.Для достижения этой цели в диссертации решались следующие основные задачи:Исследование совместной адсорбции амфифильного неионного полимера и белкана границе жидкость – газ.Определениеморфологииадсорбционныхслоѐвамфифильногонеионногополимера и белка с помощью атомно-силовой микроскопииОпределение концентрационных и кинетических зависимостей комплекснойдинамической поверхностной упругости и поверхностного натяжения растворов смесибелков и полиэлектролитов с помощью метода осциллирующего барьера и методаосциллирующего кольца.Определение кинетических зависимостей поверхностной концентрации растворовсмеси глобулярных белков и полиэлектролитов с помощью эллипсометрии.Определениеморфологииадсорбционныхслоѐвглобулярныхбелковвприсутствии полиэлектролитов с помощью атомно-силовой микроскопии.Определение влияния денатурантов на кинетические и концентрационныезависимостиповерхностныхсвойстврастворовполиэлектролитов.7смесиглобулярныхбелковиСравнениеконцентрациирезультатовсрасчетакинетическойэкспериментальнымиданнымизависимостидляповерхностнойрастворовкомплексовбелок/полиэлектролит и определение эффективного заряда комплекса.Положения и результаты, выносимые на защиту:1.
Обнаружение и интерпретация трех локальных максимумов на кинетическойзависимости динамической поверхностной упругости растворов смеси поли(Nизопропилакриламида) с β-казеином и их интерпретация.2. Особенности поверхностной вязкоупругости растворов смеси белков с ПСС иПДАДМАХ при различных рН.3. Особенности поверхностной вязкоупругости растворов смеси белков с ПСС иПДАДМАХ в присутствии денатурантов,4. Синергетическое действие ПСС и гидрохлорида гуанидина на динамическиесвойства адсорбционной пленки лизоцима.5. Механизм формирования адсорбционных пленок в растворах смеси белков иполиэлектролитов в присутствии и отсутствии денатуранта.6.
Определениевлиянияструктурнойорганизациивзаимодействия с полиэлектролитом в поверхностном слое.8белканамеханизмОбзор литературыI.1. Строение белковБелки представляют один из важнейших классов природных высокомолекулярныхсоединений и имеют огромное значение для функционирования живых организмов.Белки участвуют в обменных процессах, являются строительным материалом живойклетки, играют роль биокатализаторов, выполняют сигнальную функцию, участвуют вформировании иммунного ответа.Возможность реализации столь различных по своему характеру функций связана,прежде всего, с особенностями пространственного строения молекул белков, которое взависимости от последовательности одних и тех же аминокислотных остатков можетбыть весьма разнообразным [42].Молекулы белков состоят из одной или нескольких полипептидных цепей,построенных из аминокислотных остатков. Последовательность аминокислотныхостатков в белковой цепи называют первичной структурой.На основе данных рентгеноструктурного анализа Полингом были определенынаиболее устойчивые конформации полипептидной цепи - α-спирали и складчатые βслои [43].
Данные конформации полипептидной цепи представляют элементывторичной структуры белка и стабилизируются за счет водородных связей. В α-спиралигруппа С=О- одной пептидной связи образует водородную связь с группой N-H- другойпептидной связи, отстоящей от первой на четыре аминокислотных остатка. В β-листахполипептидная цепь находится в растянутом состоянии, а ее С=О- и N-H- группысвязаны водородными связями с такими же группами соседней, параллельноориентированнойполипептиднойцепи.α-спиралииβ-листыперемежаютсянеупорядоченными участками, в которых белковая цепь обладает значительнойгибкостью [44].Наличие гибких участков позволяет белковой Молекуле сворачиваться в глобулу,приобретая определенную пространственную третичную структуру.
Именно этаструктура оказывается биологически функциональной. Такая укладка полипептиднойцепистабилизируетсякаксильнымивзаимодействиями9засчетобразованиядисульфидныхмостиковмеждуостаткамицистеина,такиболееслабымивзаимодействиями - электростатическими, ван-дер-ваальсовыми, водородными связямии, прежде всего, гидрофобными. Глобулярные белки функционируют в водномокружении, в большой степени влияющем на их конформацию. Среди аминокислотныхостатков белка имеются как полярные, так и неполярные, как гидрофильные, так игидрофобные. Поскольку белковая цепь обладает некоторой гибкостью, она можетсвернуться в глобулу таким образом, чтобы гидрофобные участки преимущественноконтактировали друг с другом, а не с водой.
Тогда центральная область глобулыоказывается гидрофобной, а внешняя поверхность гидрофильной [45].В ряде случаев белок обладает четвертичной структурой – молекула белка илинадмолекулярная белковая система состоит из некоторого числа глобул, соединенныхнековалентными связями. Так лизоцим при высоких концентрациях (~1 масс. %)существует в виде димеров или более крупных олигомеров [46].В структуре белков, образованных несколькими полипептидными цепями зачастуюможно выделить несколько относительно самостоятельных участков, сходных по своимсвойствамсглобулярнымибелками,соединеннымималоструктурированнымиполипептидными участками [47].
Такие независимые фрагменты называют доменами.Количество доменов в разных белках может заметно отличаться. Лизоцим и бычийсывороточный альбумин содержат два и три домена соответственно, в молекулефибриногена внутри трех главных доменов можно выделить как минимум еще 12компактных структур [48].Характер структуры на каждом уровне организации определяется геометрическимисвойствами структур предыдущего уровня, силами взаимодействия их элементов ивзаимодействием с окружающей средой.Исследованные в данной работе белки существенно отличаются по своемустроению, структуре и стабильности.
Лизоцим и БСА – типичные глобулярные белки.Лизоцим был обнаружен во многих тканях и жидкостях живых организмов, где онвыполняетфункциинеспецифическогоантибактериальногоагента.Наиболеераспространенным является лизоцим яичного белка. Его молекулярная масса 14300а.е.м. Он состоит из 129 аминокислот, около 42% полипептидной цепи находится вформе α-спиралей . Третичная структура представляет собой плотно упакованную10глобулу, форма которой близка к форме эллипсоида с тремя характеристическимидлинами: 4,5*3*3 нм [49].
Жесткая трехмерная конформация поддерживается спомощью четырех дисульфидных связей и гидрофобных взаимодействий [50].Изоэлектрическая точка лизоцима лежит в щелочной области (pI~10.5-11), в водномрастворе при рН=7 его заряд равен +8. Заряженные функциональные группы в основномизолированы друг от друга и неравномерно распределены по глобуле.
Значительное ихчисло расположено в районе щели – наиболее гидрофильной области молекулы.Наиболее гидрофобная область лежит на противоположной щели стороне глобулы.Белок обладает высокой стабильностью и может выдерживать кратковременноекипячение без необратимой денатурации [51].БСА менее устойчив, чем лизоцимом, однако также может выдерживать довольнодлительное нагревание – до 10 часов при температуре 60оС [52]. БСА - один из самыхраспространенных белков крови и выполняет транспортную функцию. Глобула БСАимеет сердцевидную форму с размерами главных осей 1,7*4,2 нм при нейтральном рН ипретерпевает несколько обратимых конформационных переходов с увеличениемкислотности среды [53,54]. По сравнению с лизоцимом, БСА крупнее: молекула состоитиз 580 аминокислотных остатков, молярная масса составляет 66700 а.е.м.
Основнымиэлементами вторичной структуры выступают α-спирали, стабилизированные 17дисульфидными мостиками и содержащие 67% процентов аминокислотных остатков. Вотличие от лизоцима, изоэлектрическая точка БСА лежит в кислой области (~4,8-5,4), ив растворе при нейтральном рН молекула имеет заряд -18 [52]. Заряженные участкираспределены неравномерно вдоль поверхности глобулы: наибольшее количествоотрицательнозаряженныхгруппсосредоточеновдомене,образованномN-терминальным концом молкулы, а положительных – в домене, образованном Стерминальным концом молекулы [52,55].Также как и БСА, фибриноген - белок плазмы крови, участвующий в процессе еесворачивания, однако его строение существенно отличается от строения БСА илизоцима, рассмотренного выше.
Фибриноген представляет сложный мультидоменныйбелок, в котором можно выделить три основных домена: центральный Е-домен и двабоковых D-домена, соединенные α-спиральными участками. D и Е-домены образованыдвумя наборами из трех полипептидных цепей (Аα, Вβ и λ), соединенных 2911дисульфидными мостиками. N-концы полипептидных цепей образуют Е-домен, в товремя как С-концевые части Вβ и λ цепей образуют D-домены [48]. С-концевые участкиАα цепей образуют компактные αС-домены, соединенные с основной частью молекулыс помощью гибких α-спиральных участков [56].
Молекулярная масса фибриногенамаксимальна среди исследуемых в диссертационной работе белков (340 000 а.е.м) иразмеры глобулы составляют 9*4,75*6 нм [57]. При нейтральном рН фибриногензаряженотрицательно(суммарныйзаряд-10,pI~5-5.4),наибольшаядоляотрицательного заряда сосредоточена на E и D-доменах, в то время как αС-доменызаряжены положительно. Было показано, что E и D- домены являются болеегидрофобными по сравнению с αС-доменами[58].β-казеин составляет основную долю белка в молоке. В отличие от рассмотренныхранее белков он не имеет третичной структуры, а его вторичная структура выраженаочень слабо [59].
В водных растворах β-казеин не образует компактных глобул ипредставляет гибкую неупорядоченную макромолекулу. Молекула β-казеина состоит из209 аминокислотных остатков, его молекулярная масса составляет 24000 а.е.м [60].Также как БСА и фибриноген, β-казеин при нейтральном рН заряжен отрицательно общий заряд молекулы около -30, распределение заряда по цепочке неравномерно –большую часть отрицательного заряда (примерно -20) несут первые пятьдесятаминокислотных остатков [61].I.2. Химическая денатурация белковПод действием различных химических и физических факторов белок можетутрачивать свою пространственную конфигурацию, спонтанно возникающую в водномрастворе и заданную последовательностью аминокислотных остатков, т.е. нативнуюструктуру.
Этот процесс называется денатурацией [42]. Важно отметить, чтоденатурация затрагивает только третичную и вторичную структуру белка, самаполипептидная цепочка остается при этом неизменной.Денатурация может быть вызвана введением в раствор денатурирующих агентов.Несмотря на то, что взаимодействие белков с денатурантами исследовалось несколькодесятилетий, единого мнения о том, как именно протекает этот процесс, до сих пор нет.12Было предложено два основых механизма взаимодействия денатуранта с глобулой:прямой и косвенный [17–20,62,63]. В случае прямого механизма предполагаетсяналичие специфических мест связывания на поверхности глобулы, к которым за счетэлектростатического или ван-дер-ваальсового взаимодействия, а также образованияводородных связей, присоединяются молекулы денатуранта [17,64]. При этомразрушается существовавшая ранее сетка водородных связей, стабилизировавшихтретичную и вторичную структуру белка.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
