Диссертация (1150176), страница 5
Текст из файла (страница 5)
При этом пространственное распределение глобул внутри первичногоагрегата и распределение первичных комплексов внутри вторичного указывает нафрактальную структуру образующихся комплексов, аналогично комплексам БСА/ПСС.Ферментативная активность лизоцима либо полностью утрачивается, либосохраняется, но заметно ингибируется ПСС. Более сильное действия ПСС на лизоцим посравнению с другими полиэлектролитами можно объяснить его более высокойплотностью заряда в растворе.А.Б.Рис.
1. Потенциальная поверхность (-0,1кТ/е (красная) и 0,1кТ/е (синяя)) вокруг БСА(А.) и лизоцима (Б.) при рН=7 и I=0,15 [116]¸С помощью динамического рассеяния света было показано, что образованиюмакроскопических агрегатов и фазовому разделению предшествует образованиемикроскопических растворимых комплексов белок-полиэлектролит. В работе [112]исследовалось с помощью нефелометрического титрования и квазиупругого рассеяниясвета образование комплексов различной структуры между рядом полиэлектролитов,как катионных, так и анионных и тремя белками: БСА, рибонуклеазой и лизоцимом.22Было обнаружено значительное различие во взаимодействии полиэлектролиов с БСА илизоцимом.
В первом случае комплексы с полианионами начинают образовываться прирН заметно выше изоэлектрической точки при отрицательном заряде молекулы БСА.При этом с поликатионами образование комплексов начинается только, когда общийзаряд белка становится отрицательным.Этот факт можно объяснить, если принять во внимание неравномерноераспределение положительных участков на поверхности глобулы БСА вблизиизоэлектрической точки и более равномерное распределение отрицательно заряженныхучастков.Эти выводы [112] согласуются с данными расчетов с помощью программы DelPhi,которая позволяет оценить распределение заряда вдоль поверхности глобулы ивизуализировать потенциальные поверхности вокруг глобулы (рис.1) [13,116].В работе [130] были проведены расчеты взаимодействия лизоцима и полианионов спомощью метода Монте Карло.
При учете только электростатических сил максимальноечисло адсорбированных полимерных сегментов наблюдалось при концентрации соли 10мМ, что не согласуется с экспериментальными данными [13]. Лучшего согласия удаетсядобиться, если учитывать неэлектростатические взаимодействия.I.4. Поверхностные свойства растворов белковПервые работы по свойствам поверхностных белковых пленок были посвящены восновном нанесенным пленкам [132–134].
Используя аналогию с монослояминизкомолекулярных ПАВ большинство авторов пришло к выводу, что в поверхностномслое молекула белка разворачивается таким образом, чтобы сделать максимальнойплощадь контакта гидрофобных участков с воздушной фазой и гидрофильных групп сводной фазой [133–135]. На разрушение глобулярной структуры указывали такжеданные по толщине белковой пленки и уменьшению ферментативной активности белковв поверхностной пленке.Одно из первых систематических исследований адсорбционных белковых пленокбыло выполнено Гремом Филипсом [30,136–138]. Были определены кинетическиезависимости поверхностного давления,поверхностной концентрации, изотермы23адсорбции и поверхностного давления, проведены реологические исследования.
Вкачестве объектов исследования использовались адсорбционные пленки БСА, лизоцимаи β-казеина. Данные белки сильно отличаются по своей структуре, что отражается вповерхностных свойствах их растворов. В случае БСА и лизоцима были выделены двеосновные стадии адсорбции. На первой стадии происходит одновременный ростповерхностного давления и поверхностной концентрации в результате формированиябелкового монослоя.
Вторая стадия для БСА характеризуется примерным постоянствомповерхностной концентрации и ростом поверхностного давления. Данное наблюдениебыло связано с конформационными изменениями, приводящими к разрушениютретичной структуры белка, и образованием мультислоев [137]. В случае лизоциматакже предполагается частичное разворачивание глобул в области малых концентраций.Однако при поверхностном давлении больше 8 мН/м, возникают стерическиепрепятствия для развертывания глобул и лизоцим начинает адсорбироваться в нативномсостоянии.
Резкий рост адсорбции при высоких концентрациях в объеме раствора и припостоянном поверхностном давлении связан с образованием второго и последующихслоев. Адсорбция β-казеина приводит к более быстрому падениюповерхностногонатяжения, чем адсорбция глобулярных белков. Первая стадия адсорбции такжехарактеризуется конформационными переходами в поверхностном слое, а вторая-образованием мультислоев [59,136,139,140].Появление метода малоуглового отражения нейтронов и развитие методарадиоактивных индикаторов позволило получить более точные данные по адсорбциибелков, иногда отличающиеся от результатов Грема и Филипса [31–33,139,141,142].
Вчастности данные по отражению нейтронов свидетельствуют о сохранении белком егонативной структуры в процессе адсорбции. Отклонение толщины адсорбционныхпленокотхарактерныогоразмераглобулвобластиизотермыадсорбции,соответствующей монослою, объясняется деформацией глобул в поверхностном слоебез значительных изменений третичной структуры [32,141].
В частности, этот выводсправедлив Наиболее часто аргументы в пользу сохранения белком нативной структурыприводятся в случае адсорбции лизоцима, глобулы которого обладают высокойстабильностью [31,143,144]. При малых концентрациях ориентация молекул в монослоетакова, что большая полуось глобулы располагается параллельно поверхности24(ориентация «side-on»). При достижении некоторой критической концентрации,молекулы меняют свою ориентацию с «side-on» на «end-on» - ориентацию при которойбольшая полуось молекулы перпендикулярна поверхности, что приводит к дальнейшемуросту адсорбции и увеличению толщины поверхностного слоя.Изменениетолщиныадсорбционногослояфибриногенасувеличениемконцентрации также связано с изменением ориентации макромолекулы в поверхностномслое [145–147]. При малых концентрациях вытянутые молекулы белка ориентируютсяпараллельно поверхности и толщина поверхностного слоя близка к меньшему размерумолекулы фибриногена.
С увеличением концентрации ориентация молекул меняется итолщина поверхностного слоя растет.На изображениях, полученных с помощьюатомно-силовой микроскопии для адсорбционных пленок фибриногена, хорошо видныотдельные молекулы, и в ряде случаев можно выделить области, соответствующиеразличным доменам, что позволяет сделать выводы о взаимном расположения частеймолекулы в поверхностном слое [58,148].Изображения, полученные с помощью атомно силовой микроскопии дляповерхностных пленок глобулярных белков, таких как лизоцим и БСА, показали, чтообразующиеся в этом случае пленки имеют гладкую однородную структурустолщинами, близкими к значениям, характерным для монослоев белков [149,150]. Вслучае неглобулярного β-казеина, в области малых концентраций (<1*10-4 масс.
%) иотносительно малых времен жизни поверхности (<8 часов) пленки также были гладкими[151]. Однако с увеличением концентрации и времени жизни поверхности наблюдалосьпоявление агрегатов размером 18-25 нм.Значительная часть работ по динамическим поверхностным свойствам растворовбелков посвящена анализу кинетических зависимостей поверхностного натяжения[137,143,144,146,152,153].
Динамическое поверхностное натяжение монотонно падает свозрастом поверхности, достигая равновесного значения. Для ряда белков, например,для лизоцима и фибриногена поверхностное натяжение оставалось постоянным иблизким к значениям для воды в течение некоторого времени - индукционного периода.В случае фибриногена авторы [145,146] объясняют данное явление тем, что в начальныйпериод времени концентрация молекул на поверхности недостаточна для того, чтобывызвать заметное изменение поверхностного натяжения.
Для лизоцима при постоянном25поверхностном давлении наблюдался рост поверхностной концентрации, что можетбыть связано с с фазовым переходом в поверхностном слое из газообразного состоянияв жидко-растянутое и изменением ориентации белка с «side-on» на «end-on» [143], либо,как и в случае фибриногена, с наличием некоторой критической поверхностнойконцентрации, после достижения которой наблюдается рост поверхностного давления[144].I.5. Кинетика адсорбции белковНа раннем этапе исследования кинетики адсорбции белков были выделены триосновные стадии этого процесса: диффузия макромолекул из объема раствора кповерхности, преодоление потенциального адсорбционного барьера и проникновение вповерхностный слой, конформационные переходы внутри поверхностного слоя [156].Адсорбционный барьер, прежде всего, связан с электростатическим отталкиваниембелковых молекул от одноименно заряженной межфазной границы и возрастает приувеличении концентрации.
Первые адсорбированные молекулы приводят к образованиюилимодификациидвойногоэлектрическогослояумежфазнойграницы,препятствующего адсорбции последующих молекул. До настоящего времени былосделено несколько попыток учесть элетростатический барьер при описании адсорбциибелков на границе жидкость-газ [154–156]. Недавно использование уравненияСмолуховского для описания диффузии белковых глобул во внешнем поле, теориидвойного электрического слоя и теории случайной последовательной адсорбциипозволило получить простое кинетическое уравнение адсорбции белков и комплексовбелок/ПАВ [157].В рассматриваемой модели межфазная граница раствор/воздух совпадает сплоскостью x = 0 прямоугольных декартовых координат.
рН раствора белка отличаетсяот изоэлектрической точки и, следовательно, адсорбированные глобулы создаютэлектрическое поле вблизи поверхности. Если расстояние от поверхности превышаетразмеры глобулы, то можно пренебречь зависимостью электрического поля от у, z исчитать, что заряд равномерно распределен вдоль плоскости х = 0 .26Более грубое допущение заключается в представлении глобулы в виде частицы сточечным зарядом в ее центре. Tакое приближение допустимо, если эффективнаятолщина двойного электрического слоя много больше размеров глобулы.Для описания потока заряженных частиц j к поверхности в электрическом поле,созданном уже адсорбировавшимися частицами, применяется обобщенное уравнениеСмолуховского:c c D j D ctxx x kT x (1)где с - концентрация, t - время, Т - абсолютная температура, k – постоянная Больцмана,D -коэффициент диффузии, Ф - потенциал внешнего поля.В общем случае потенциал Ф связан со всеми силами, действующими назаряженную гидрофобную глобулу.
Если поверхностный слой уже содержит некотороеколичествоадсорбированныхэлектрическоеполекороткодействующиедвойногозаряженныхмолекул,электрическогогидрофобныеслоявзаимодействия.тоосновнойу межфазнойвкладдаетграницыХарактеристическаяидлинаэлектростатических сил отталкивания намного превышает расстояния, на которыхдействуют гидрофобные силы притяжения.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
