Диссертация (1150176), страница 4
Текст из файла (страница 4)
Это объясняется изменением механизмасвязывания, частичным разрушением глобулы и переходом комплекса в раствор.Благодаря способности лизоцима образовывать олигомеры в состав одного комплексаможет входить несколько молекул белка [102]. Метод флюоресцентных меток позволилопределить числа агрегации мицеллоподобных кластеров для различных соотношениймежду концентрацями компонентов.
Числа агрегации для одинаковых молярныхотношений оказалась различными и большими для более высоких концентрацийлизоцима [21]. Это наблюдение также свидетельствует в пользу предположения о том,что в состав комплекса входит несколько молекул белка. Результаты экспериментов помалоугловому рассеянию нейтронов и рентгеновских лучей показали, что модельожерелья неприменима к растворам лизоцим/ПАВ [103–105]. Белок сохраняет своюглобулярную структуру в широком диапазоне концентраций ДСН.
Согласно одному изпредположений, молекула белка встраивается в мицеллу ДСН без значительныхизменений третичной структуры [105]. Было выдвинуто также предположение, чтонасыщается молекулами ПАВ и подвергается разворачиванию только один из доменовлизоцима [104].17I.3. Образование комплексов между белками и полиэлектролитами в раствореБелки и полиэлектролиты интенсивно взаимодействуют в растворе с образованиемкомплексов различной структуры [3,11,13,112–114]. Поскольку комплексы образуются,прежде всего, за счет электростатических взаимодействий, то их свойства во многомопределяются зарядом взаимодействующих макромолекул [112,115,116].
В зависимостиот рН раствора белки могут иметь как положительный, так и отрицательный заряд.Нефелометрическое титрование представляет один из самых распространенных методовизучения подобных систем [11,113]. В начальный момент времени, когда компонентыодноименно заряжены, раствор прозрачен. Постепенно с изменением рН среды меняетсязаряд белковой глобулы.
Начиная с некоторого критического рНс раствор становитсямутным в результате образования образования первичных комплексов белокполиэлектролит. Значение рНс может соответствовать одноименному заряду глобул[113,116,117]. В этом случае взаимодействие между компонентами осуществляется засчет неравномерного распределения заряда на поверхности глобулы, когда отдельныеучастки поверхности имеют заряд, противоположный общему заряду макромолекулы[112]. Оценки размеров областей связывания показывают, что для БСА их площадьпочти в два раза меньше, чем для β-лактоглобулина (БЛГ) и составляет около 10 нм[114]. Гидрофобные взаимодействия приводят к увеличению сродства образованиякомплексов [118].Было предложено несколько вариантов структуры первичных комплексов. Вранних работах предполагалось, что полиэлектролит располагается вокруг молекулыбелка таким образом, чтобы максимизировать контакт между противоположнозаряженными участками и минимизировать отталкивание [119].
Свободные частимолекулы полиэлектролита располагаются в виде петель вокруг глобулы таким образом,чтобы обеспечить контакт между раствором и гидрофильными участками глобулы [119].Позднее Дубиным и сотрудниками при исследовании комплексов ПДАДМАХ иразличных белков была предложена модель, согласно которой молекулы белкавыступали в качестве бусин, удерживаемых молекулой полиэлектролита (модельожерелья).[2].Размерыпервичногокомплекса18близкикразмераммолекулполиэлектролита в водном растворе и конформация полиэлектролита в связанномсостоянии мало отличается от конформации свободного полиэлектролита [13,14,113].При дальнейшем отклонении рН от изоэлектрической точки белка мутностьраствора растет вследствие ассоциации первичных комплексов за счет дипольдипольныхикритическогогидрофобныхзначениярНфвзаимодействий.наблюдаетсяПрифазовоедостиженииразделениеследующегораствора[8].Образовавшиеся крупные агрегаты образуют отдельную фазу – фазу коацерватов[3,8,11,120].Помимо рН, существенное влияние на образование комплексов в растворахбелок/полиэлектролитоказываетионнаясилараствора.Максимумсродствабелок/полиэлектролит как функции концентрации добавленной соли наблюдается длятаких различных систем, как лизоцим/хондроитин сульфат и лизоцим/гиалуроноваякислота[121], БЛГ/ПСС [113] в одной и той же области концентрацийиндифферентного электролита: 10-30 мМ.Когда длина Дебая (к-1) мала по сравнению с радиусом белка, то все силыотталкивания экранированы.
При достаточно высокой концентрации соли экранируютсяи силы электростатического притяжения, приводя к уменьшению сродства белокполиэлектролит. Максимум сродства наблюдается при ионной силе, соответствующейпримерно дебаевскому радиуса белка. Для глобул с радиусом около 2-4 нм, эторасстояние соответствует ионной силе 20-60 мM [116].Распределение заряда вдоль цепи полиэлектролита также существенно влияет навзаимодействие белков и полимеров [115]. Однако применение метода Монте Карлопоказало, что жесткость цепи сильнее влияет на взаимодействие между компонентами,чем линейная плотность заряда полиэлектролита [122].
Результаты расчетов былиподтверждены экспериментом [114].Лизоцим и БСА - модельные белки и объемные свойства их смесей с различнымиполиэлектрлитами хорошо изучены. Образование комплексов БСА с различнымиполианионами было подробно исследовано в работе [13]. Для всех систем наблюдалосьобразование первичных комплексов БСА/полиэлектролит при одноименном заряде наобоих компонентах. В частности, образование первичных комплексовс ПССнаблюдалось уже при рН=6, когда и белок и полиэлектролит заряжены отрицательно19[13,93]. Комплексы хорошо описывались моделью ожерелья и размер комплекса былблизок к размеру молекулы ПСС (около 40 нм по данным динамического рассеяниясвета) [113,114,123].
При рНс<рН<рНф размер комплекса увеличивался вдвое. Суменьшением величины рН, мутность раствора возрастала, и при рН=4 наблюдалосьобразование коацерватов.На основе данных малоуглового рассеяния нейтронов для растворов БСА/ПССбыл сделан вывод о фрактальной структуре образующихся комплексов [11]. Анализпрофиля рассеяния показал, что в процессе связывания молекулы белка частичноразворачиваются.
О частичном развертывании глобул лизоцима при взаимодействии сПСС сообщается также в работе [3].Фрактальная размерность комплексов БСА/ПСС уменьшается со смещением рН вкислую область. Увеличение заряда молекулы белка с ростом рН приводит к ростуэлектростатического отталкивания между молекулами БСА внутри комплекса.Комплекс БСА/ПСС становится менее компактным и принимает более вытянутуюформу,чтобыминимизироватьэлектростатическоеотталкивание.Изменениесоотношения компонентов не влияло ни на структуру растворимых комплексов, ни наструктуру коацерватов[11].По сравнениюсПСС, ПДАДМАХ обладает большей жесткостью цепи именьшей плотностью заряда [115].
Для образования комплексов с ПДАДМАХнеобходимо чтобы белок и полиэлектролит несли противоположные заряды. Дляобразования комплексов с этим полиэлектролитом требовался наибольший посравнению с другими поликатионами отрицательный заряд: -6 для образованияпервичных комплексов и -23 для образования коацерватов [113].
В то же время в работе[99] отмечается, что взаимодействие между ПДАДМАХ на БСА начинается нижеизоэлектрической точки белка. Вероятно, что расхождение между выводами различныхавторов связаны с различиями в ионной силе и отношении концентраций компонентов.При ионной силе выше 50 мМ взаимодействие БСА и ПДАДМАХ уменьшаетсявследствие экранирования зарядов. При этом происходит рост рНс. При уменьшенииионной силы до 30 мМ, дальнейшее уменьшение этой величины не вызывает изменениясродства комплексообразования.
Наиболее интенсивно процесс образования комплексовдля системы БСА/ПДАДМАХ протекает при ионной силе 20±10мМ NaCl [116].20В отличие от системы БСА/ПСС, образование комплексов между БСА иПДАДМАХзависитототношенияконцентрацийкомпонентов[8,14].Еслиполиэлектролит находится в избытке, то распределение глобул вдоль цепочекполиэлектролита происходит случайным образом. Если же в избытке находится белок,то количество приходящихся на одну молекулу полиэлектролита глобул возрастает иони распределяются более плотно и упорядоченно.
Наличие свободного БСА запускаетпроцесс вторичного связывания. Авторы [14] предполагают, что этому процессуспособствуют гидрофобные взаимодействия между связанным и свободным БСА.Взаимодействие лизоцима с полиэлектролитами многократно изучалось сприменением методов малоуглового рассеяния нейтронов [3,124–129], электронноймикроскопиидифференциальной[126],сканирующейкалориметрии[12],динамического квазиупругого рассеяния света [13,112], нефелометрического титрования[12,13,112].
Также были проведены расчеты с помощью метода Монте Карло [130] ипрограммы DelPhi [116]. В отличие от системы БСА/ПСС, свойства растворовлизоцим/ПССсильнозависяототношенияконцентрацийкомпонентов.Намакроскопическом уровне это проявляется в различном состоянии образцов: они могутбыть прозрачными, мутными, гелеобразными, могут претерпевать фазовое разделение.Этоуказываетнасуществованиетрехразличныхлокальныхструктур,чтоподтверждается методом малоуглового рассеяния нейтронов [124–129]. В случаепрозрачных растворов этот метод обнаруживает сосуществование гибких развернутыхмолекул лизоцима и молекул ПСС, также представляющих гибкие заряженные цепочки.В данном случае полиэлектролит действует подобно ПАВ, вызывая разворачиваниебелка. В работе [12] было обнаружено, что из нескольких изученных полиэлектролитовтолько ПСС вызывает разворачивание белка уже при комнатной температуре.Когда при смешении растворов ПСС и лизоцима образуется мутный гель, белоксохраняет свою нативную структуру.При этом одна глобула белка можетвзаимодействовать с несколькими молекулами ПСС, которые оказываются сшитымимежду собой [127].
Если образец одновременно мутный и жидкий, можнопредположить, что глобулы белка плотно упакованы внутри некоторых первичныхагрегатов, которые также содержат полиэлектролит. Размер агрегатов меняется от 6 прималом содержании ПСС до 15 нм при увеличении концентрации полиэлектролита. При21этом структура ядра агрегата сохраняется и его заряд близок к нейтральному. КогдаПСС находится в избытке, внешняя поверхность агрегата более шероховатая, некоторыечасти цепей оказываются за пределами поверхности иобразуют структуру,напоминающую корону вокруг ядра [131]. Первичные агрегаты способны к дальнейшейагрегации.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
