Диссертация (1150106), страница 7
Текст из файла (страница 7)
Дозировали нижнийацетонитрильный слой. Объем дозы 5 мкл (микрошприц Hamilton объемом 10мкл). В полученные смеси последовательно добавляли точные навескикамфоры с повторением перед каждой стадией анализа процедур ихперемешивания и центрифугирования.Внутренний стандарт н-тридекан (ХЧ) добавляли непосредственно висходные образцы до подготовки проб.3.4 Условияхроматографическогоанализаобразцовсодержащихкамфору фармацевтических препаратовГазохроматографический анализ проводили на хроматографе Цвет-500Мс пламенно-ионизационным детектором и стеклянной насадочной колонкойразмерами 3м×2мм с5 % SE-30 на Хроматоне N (0,16-0,20 мм) визотермических условиях при температуре 140 0С.
Температуры детектора ииспарителя составляли 180 и 2000С, соответственно. Газ-носитель-азот,объемная скорость 10 мл/мин. Объем дозируемых проб 5 мкл (микрошприцHamiltonобъемомиспользованием(Ampersend,10мкл).Обработкупрограммно-аппаратногоМосква,версия15).Дляхроматораммкомплексапроводилис«Мультихром»статистическойобработкиэкспериментальных данных использовали программное обеспечение MicrosoftExcel (пакет ПО Microsoft Office 2003) и ORIGIN 8.0.
Число параллельныхопределений площадей пиков целевых компонентов при анализе каждого изобразцов составляло не менее пяти. Для оценки погрешностей полученныхрезультатов в случае трехкратной стандартной добавки использовали методнаименьших квадратов, ав случае двойной добавки средние значенияпогрешностей, найденных содержаний камфоры для первой и второй добавок.393.5 Приготовление растворов моноэтаноламина в водеДля проверки возможностей метода СД использовали серию растворовМЭА в воде (10 мл) с концентрациями 0.125, 0.25, 0.5, 1.0 и 1.5 мкг/мл,приготовленных методом последовательных разбавлений. Первый или второйрастворы рассматривали как анализируемые образцы, а все остальные – какобразцы с введенными в них стандартными добавками.Альтернативный способ включал добавку к 1 мл раствора МЭА сконцентрацией 2 мкг/мл последовательно по 5 мкл раствора МЭА сконцентрацией 200 мкг/мл, что приводит к образцам с концентрациями 3 и 4мкг/мл.
В качестве контрольных образцов использовали растворы пиридина вводе с такими же концентрациями.3.6 Условия хроматографического анализа и параметры ESI-детекторапри регистрации положительно заряженных ионовАнализ проб проводили на жидкостном хромато-масс-спектрометреShimadzu LC-20AB с масс-селективным детектором Shimadzu LCMS-2010EV(ESI). Колонка Supelcosil LC-NH2 150 × 3 мм, размер частиц сорбента 3 мкм,элюент: компонент А – 0.01 % раствор муравьиной кислоты в воде, компонентБ – ацетонитрил; изократический режим элюирования: 97 % Б, объемнаяскорость подвижной фазы через колонку 0.3 мл/мин, температура термостатаколонки 40 °С, время удерживания МЭА 4.5 мин, объем проб 5 мкл.
Дляустранения эффектов «памяти» хроматографической системы при измененииконцентрацийМЭАванализируемыхрастворах,ихдозироваливпоследовательности увеличения концентраций МЭА, а результаты первогоизмерения отбрасывали. С этой же целью при переходе к образцам с другимиконцентрациями МЭА между ними дозировали 1 % водный раствор уксуснойкислоты и несколько проб воды.Давление газа-осушителя 0.1 МПа, расход газа-распылителя 1.5 л/мин,температура 200 °С, температура CDL (изогнутого капилляра десольвации) 250°С, напряжение на электроспрее 4000 В, напряжение на электронном40умножителе 1500 В. Помимо детектирования аналитов по полному ионномутоку проводили детектирование по отдельным ионам (SIM, для МЭА ионы [М+ Н]+ с m/z 62).
Для регистрации параметров хроматографических пиковиспользовали программное обеспечение LCMS Solution (версия 3). Числопараллельных определений площадей пиков МЭА в каждом из режимовсоставляло не менее пяти. Статистическую обработку данных проводили сиспользованием программного пакета Microsoft Excel 2003.На рисунках 3.1 и 3.2 представлены масс-спектр и масс-хроматограммаМЭА в водном растворе. Сигнал в масс-спектре с m/z 105 является фоновым,m/z 103 соответствует ионам [МЭА + СН3CN +H]+. Масс-хроматограммы имасс-спектрприведеныдляиллюстрацииотсутствиявлиянияпиковрастворителя на точность результатов определений.Inten. (x100,000)62.05103.105.0105.052.556.00 59.050.0 51.0050.055.060.073.9067.0065.070.075.079.9583.0585.1080.085.090.90 93.9090.095.0113.1099.90100.0105.0110.0115.0Рис. 3.1.
Масс-спектр моноэтаноламина в водном растворе.Рис. 3.2. Масс-хроматограмма моноэтаноламина в водном растворе.41121.00120.0m/z3.7 Приготовлениеградуировочныхобразцов3-(2,2,2-триметилгидразиний)пропионовой кислоты и подготовка проб мочик анализуПробы мочи добровольцев центрифугировали при 15000 g в течение 10минут, после чего отбирали верхний слой. Градуировочные растворы 3-(2,2,2триметилгидразиний)пропионовой кислоты (THP) в моче с концентрациями 10,50, 100, 400, 500, 600 и 1000 мкг/мл готовили методом последовательныхразбавлений.ВсепробынепосредственнопередВЭЖХ-МСанализомразбавляли деионизованной водой в 100 раз.3.8 Условияхроматографическогоанализа3-(2,2,2-триметилгидразиний)пропионовой кислоты в мочеАнализ проб проводили на жидкостном хромато-масс-спектрометреShimadzu LC-20AB с масс-селективным детектором Shimadzu LCMS-2010EV(ESI).
Колонка Supelcosil LC-NH2 150 x 3 мм, размер частиц сорбента 3 мкм,элюент: компонент А – 10мМ раствор формиата аммония в воде, компонент Б –ацетонитрил; изократический режим элюирования: 70 % Б, объемная скоростьподвижной фазы через колонку 0.35 см3/мин, температура термостата колонки40 °С, объем проб (петли) 5 мкл, время удерживания THP 7.3 мин.Давление газа-осушителя 0.1 МПа, расход газа-распылителя 1.5 л/мин,температура 200 °С, температура CDL (изогнутого капилляра десольвации) 250°С, напряжение на электроспрее 4000 В, напряжение на электронномумножителе 1500 В.
Помимо детектирования аналитов по полному ионномутоку проводили детектирование по отдельным ионам (SIM, для THP ион с m/z147). Регистрацию параметров хроматографических пиков проводили сиспользованием программного обеспечения LC-MS Solution (версия 3). Числопараллельных определений площадей пиков составляло не менее пяти. Длястатистическойобработкиэкспериментальныхданныхиспользовалипрограммное обеспечение Microsoft Excel (2003) и Origin (версия 8.1).42Рисунок 3.3 Масс-спектр THP в пробе мочи (способ ионизации – электроспрей).Масс-хроматограммыимасс-спектр приведеныдля иллюстрацииотсутствия влияния пиков растворителя на точность результатов определений.3.9 Контроль инертности хроматографических систем для анализасодержащих камфору фармацевтических препаратов3.9.1 Приготовлениетрехкомпонентнойтест-смесидляконтроляинертности хроматографических системВ качестве тест-веществ для контроля инертности хроматографическойсистемы, были использованы 2,3-бутандиол (ХЧ), втор.-бутилтолуол и 1гептанол (ХЧ для хроматографии).
Некоторые свойства этих соединений настандартных неполярных полидиметилсилоксановых неподвижных фазахприведены в таблице 3.1.Таблица 3.1 Физико-химические и хроматографические свойства тестсоединенийКомпонент2,3-Бутандиолвтор.Бутилтолуол1-ГептанолМол.Мол.массаформула90Ткип, 0Сd420RI ± sRIC4H10O21811,05782 ± 25148C11H161980,861081 ± 10116C7H16O1760,82953 ± 1343Исходный образецготовили смешением исследуемых соединений всоотношении 1 : 1 : 1 по объему. Следующие образцы готовили разбавлениемисходного хлористым метиленом в 10, 100 и 1000 раз, соответственно.
Объемдозы 2 мкл (микрошприц Hamilton объемом 10 мкл).3.9.2 Приготовление тест-образца камфоры для контроля инертностихроматографическойсистемыприанализефармацевтическихпрепаратовДля приготовления модельного образца № 1 11,9 мг камфоры и точнуюнавеску (10,0 ± 0,5) мг н-тридекана (внутренний стандарт) добавляли в 10 млсмеси воды и этилового спирта (1:1), затем экстрагировали 1 мл хлористогометилена.
Отбирали и дозировали нижний слой, объем дозы 1 мкл(микрошприцHamilton объемом 10 мкл). Образцы №№ 2, 3 и 4 готовилиразбавлением первого в 2, 4 и 8 раз, соответственно. Модельные образцы сиспользованием хлороформа в качестве растворителя готовили аналогичнымобразом, но в данном случае масса камфоры составляла (точная навеска) (90 ±0,5) мг, масса тридекана (точная навеска) (20 ± 0,5) мг.3.10 Приготовлениебинарныхрастворов для контроля инертностихроматографических системСистема октан – гептанол.
Для приготовления смеси октан – гептанолготовили смесь из 100 мкл октана (ХЧ) и 100 мкл гептанола (ХЧ).Система октан – фенол. Для приготовления смеси октан – фенол бралиточную навеску фенола (ХЧ) массой 0,100 ± 0,005 г растворяли в 100 мклоктана и 1.8 мл хлористого метилена.Система октан – ди-трет.-бутилфенол.Для приготовления смеси октан – ди-трет.-бутилфенол брали точнуюнавеску ди-трет.-бутилфенола (ХЧ) массой 0,080 ± 0,005 г растворяли в 100мкл октана и 1.8 мл хлористого метилена.Система тридекан – гептанол.
Для приготовления смеси тридекан гептанол готовили смесь из 100 мкл тридекана и 100 мкл гептанола.44Во всех случаях приготовленные смеси последовательно разбавляли в 10,100, 1000 и 10000 раз. В качестве растворителя использовали хлористыйметилен (ХЧ).Количество вещества в пробе (Мх), г. вычисляли по формуле 3.1 (формулавыведена при условии, что каждый последующий раствор готовили изпредыдущего разбавлением в 10 раз):(3.1)где ρ – плотность вещества, г/мл, Vпробы – объем дозируемой пробы, мл, k– количество компонентов в исходной смеси, n – число разбавлений в 10 раз, T– деление потока при дозировании проб в капиллярную колонку со сбросом.3.11 Условия хроматографического анализа тест-смесейХроматографShimadzuGC-2014спламенно-ионизационнымдетектором.
Используемые хроматографические колонки и соответствующиеусловия анализа:- стальная насадочная колонка 3 м × 3 мм с 5 % SE-30 на Supelcoport(0.25-0.315 мм). Температура термостата колонок: 90 0С, 80 0С, 80 0С↑ 2 0С/минтемпература испарителя 180 0С, температура детектора 200 , скорость газаносителя 30 мл/мин.- капиллярная колонка HP-5 MS длиной 30 м., внутренний диаметр 0,25мм, толщина пленки фазы 25 мкм, температура термостата колонок: 90 0С, 800С, 80 0С↑ 2 0С/мин, температура испарителя 250 0С, температура детектора 2500С, поток 19,5 мл/мин, поток через колонку 0,79 мл/мин, сброс 20- стальная насадочная колонка 3 м × 3 мм с 10 % Carbowax на ИнертонеAW (0.16-0.20 мм), температура термостата колонок: 150 0С, 160 0С, 150 0С ↑ 20С/мин, температура испарителя, температура детектора, скорость газа-носителя 30 мл/мин.45Здесь и далее символы 80 0С↑ 2 0С/мин и 150 0С ↑ 2 0С/мин использованыдляобозначениярежимапрограммированиятемпературы:начальнаятемпература термостата колонок 80 0С (150 0С), затем нагрев со скоростью 2 0Св минуту.464.
Результаты и обсуждениеТакой метод количественного хроматографического анализа как методстандартной добавки можно использовать в нескольких вариантах, а именно вварианте однократной стандартной добавки и в варианте несколькихпоследовательных добавок в образец. В последнем случае иногда используютэкстраполяцию полученных значений на нулевую величину добавки. Частовстречающеесякраткоеперечислениевариантовпримененияметодастандартной добавки без их детальной характеристики неудовлетворительнохотя бы потому, что обычно при этом остается неясным, в каких случаяхнеобходимо использовать тот или иной из этих вариантов. В особенности этокасаетсяопределениялетучихкомпонентоввсложныхматрицах,представляющих собой нелетучие вязкие, гидрофобные и, нередко, термическинестабильные вещества в смесях с ингредиентами, обладающими отчетливовыраженными сорбционными свойствами.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
