Диссертация (1150106), страница 3
Текст из файла (страница 3)
2.2 Градуировочная зависимость содержания компонента в пробе отколичественного параметра хроматографического пика для линейно (1) инелинейно (2) работающего детектора.В случае нелинейной градуировочной зависимости (случай 2 на рис. 2.2)аппроксимацию полученных значений проводят не по уравнению линейнойрегрессии, а по уравнению, описывающему кривую 2.
Например, авторы [9]использовали для аппроксимации экспериментальных данных следующиеуравнения:y = a+bxm(2.5)y = a+bx+cx2 (2.6)Такие отклонения от линейности могут возникать, например, прииспользовании электроспрея в качестве метода ионизации (ВЭЖХ-МС анализ).В этом случае при проведении количественного анализа часто возникаютпроблемыневысокойвоспроизводимостирезультатовопределенийинедостаточной линейности детектирования (особенно «day-to-day») [10,11]. Длячастичной компенсации нелинейности детектирования предложено использовать дополнительный внутренний стандарт [12], выбор которого в условиях ESIдостаточно сложен.Результаты поиска в информационной системе Google по ключевымсловам “ESI, irreproducibility” свидетельствуют об активном обсуждениипроблемы невоспроизводимости результатов, полученных в условиях ESI [1316]. Возможность неконтролируемых изменений абсолютных интенсивностейсигналов практически исключает применение метода абсолютной градуировки,14который предполагает стабильность режимов работы оборудования в течениенекоторого достаточно продолжительного времени.2.1.3 Метод внутренней нормализацииМетод внутренней нормализации предназначен для оценки относительныхколичеств компонентов смесей.
В соответствии с этим традиционный вариантвнутреннейнормализациипредусматриваетизмерениеколичественныхпараметров всех зарегистрированных пиков, приведение их к единой шкалечувствительности детектирования и суммирование полученных значений.Окончательно содержание компонентов в анализируемой смеси Сi находят поформуле:Сi = fiSi/∑fiSi(2.7)где Si – нормируемый параметр хроматографического пика , fi –градуировочный множитель.Стоит отметить, что высоты пиков при такой обработке данныхиспользовать недопустимо.Из описания метода внутренней нормализации очевидно, что требуетсялишь одна хроматограмма анализируемой смеси.
Не нужно определятьабсолютное количество вводимой пробы и добавлять какой-либо стандарт. Этапростота метода сопровождается некоторыми ограничениями, которые вомногих случаях либо полностью исключают применение метода внутреннейнормализации, либо позволяют применять лишь как приближенный методопределения количественного состава пробы.Для реализации метода внутренней нормализации необходимовыполнение нескольких условий:- Коэффициенты относительной чувствительности детектора к разнымкомпонентам смесей либо можно принять равными, что является основнымисточником ошибок метода, либо они должны быть известными для всехвеществ, в том числе и для примесей. Однако на практике часто принимают15коэффициенты чувствительности близкими, особенно в тех случаях, когдачисло компонентов в смеси велико.
В высокоэффективной жидкостнойхроматографии возможно лишь нахождение градуировочных коэффициентовэкспериментально.- Все без исключения компоненты анализируемых образцов должнырегистрироваться на хроматограммах, т. е образцы не должны содержатьнелетучих, недетектируемых компонентов. Это условие часто встречается влитературе [3], однако оно не является обязательным, так как на практикеможно выделить интересующую часть хроматограммы (с определяемымикомпонентами) и использовать метод для нее, пренебрегая неразделеннымикомпонентами в остальной ее части, так как метод внутренней нормализациипредназначен только для оценки относительного содержания компонентов всмеси.Этотметоднаходитнаиболееширокоеприменениевгазохроматографическом анализе смесей заведомо летучих однотипныхсоединений, в частности – компонентов эфирных масел, нефтепродуктов и т.
д.Например авторы многих работ [17,18], используют метод внутреннейнормализации для оценки содержания компонентов эфирных масел.При отсутствии стандартов и большом количестве компонентов ванализируемой смеси данный метод анализа является единственно возможными требует меньшего количества времени, хотя погрешность количественныхопределений компонентов смеси достаточно высока.ПредложенныйНоваком[2]методконтролируемойвнутреннейнормализации заключается в следующем: к аналитической пробе массой ma ,компонентыкоторойидентифицированы(градуировочныемножителиизвестны) добавляют известное количество mz не содержащегося в пробе ихорошо определяемого на хроматограмме вещества с также известнымградуировочным коэффициентом.
Предположим, что часть пробы y не можетбыть определена (не элюирует из колонки, разлагается, остается в системеввода из-за низкой летучести, не вызывает сигнала детектора). Тогда массовую16долю добавки Z(Xz) в пробе, если выразить вклад от y в общей расчетнойформуле внутренней нормализации по аналогии с остальными составляющимикак произведение двух множителей SyKy , рассчитывают по формуле:(2.8)Индекс j относится к любому компоненту анализируемой смеси заисключением z и y.
Массовая доля Xy гипотетической не проявляемой нахроматограмме части пробы y после добавки к пробе контрольного веществасоставляет:(2.9)2.1.4 Метод внутреннего стандартаДанный способ количественного анализа относится к числу чаще всегорекомендуемых методов контроля содержания действующих веществ влекарственных препаратах и широко представлен в фармакопейных статьях,действующих на территории Российской Федерации.Этот метод предусматривает прибавление к известному количествуанализируемого образца известного количества не содержащегося в немэталонного соединения (внутреннего стандарта) и последующий анализприготовленной смеси.Содержание компонентов в анализируемом образце Сi находят поформуле:Сi = Pifiqst/Pstqсм(2.10)где Pi, Pst – площади пиков анализируемого и стандартного соединений, fi –градуировочные множители, qst и qсм – количества стандартного вещества ианализируемой смеси.Если подготовленную пробу непосредственно перед анализом разбавитькаким-либо растворителем, то степень разбавления можно не учитывать.17Преимуществом метода внутреннего стандарта является то, что при егоиспользовании ни объем вводимой пробы, ни точность ее дозирования никак невлияют на точность количественного анализа.Для выбора внутреннего стандарта обычно руководствуютсяследующими рекомендациями [2,3]:1.
Стандартное вещество должно полностью смешиваться с компонентамианализируемой пробы (растворяться в них). Кроме того оно должно бытьхимически инертным по отношению к ним, а также по отношению киспользуемым подвижным и неподвижным фазам.2. Концентрацию вещества-стандарта следует подбирать таким образом,чтобы отношение площадей (или других количественных параметров) пиковстандарта и определяемого соединения было близко к единице.3.
Пик стандартного вещества должен располагаться на хроматограмме внепосредственной близости от пиков соединений-объектов анализа, ненакладываться ни на них, ни на пики других соединений.4. Вещество-стандарт не должно содержать примесей, пики которыхнакладываются на пики определяемых соединений. Контроль в стандартенежелательных примесей является предварительной самостоятельной задачей,при этом 100 %-ная чистота стандарта не обязательна, так как пики примесейне накладывающихся на пики компонентов смеси не участвуют в обработкеколичественных параметров.В дискуссионной публикации [19] авторы предлагают использоватьосновной компонент (растворитель) в качестве внутреннего стандарта, так какэто позволяет отказаться от процедуры ввода постороннего компонента висходнуюсмесь[19].Такойвариантметодавстретилмножествоотрицательных отзывов, однако его можно использовать при анализе примесей,например, в алкогольной продукции.Частодляпроведенияколичественныхопределенийиспользуюткомбинации методов, в частности, метода внутреннего стандарта и абсолютнойградуировки [12,20,21,22].18В тех случаях, когда предлагается построение градуировочого графикадля метода внутреннего стандарта, его строят в координатах (Qi/Qst , Ri/Rst ) или(Qi, QstRi/ Rst), где Q – количество компонента, равное произведению егоконцентрациинаинжектированныйприменяетсядостаточнорезультатовприобъем.Указаннаясхемарасчеташироко, однако не обеспечивает адекватныхнелинейныхградуировочныхзависимостях.Понятиекоэффициента отклика детектора при нелинейных зависимостях перестает бытькорректным.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
