Автореферат (1145636), страница 2
Текст из файла (страница 2)
melanogaster в тесте на отрицательный геотаксис в зависимости отвозраста;•исследовать структуру мозга на стадиях личинки третьего возраста и имагоу самцов и самок D. melanogaster различных генотипов;•исследовать причину структурных дефектов медуллы у самцов-носителейаллеля sbr12, имеющих явные нарушения поведения;•определить характер локализации белка SBR в мозге D.
melanogaster вдинамике личиночного развития;•сравнить характер локализации белка SBR в нейронах с распределениембелка dFMR1, который является компонентом транспортных РНП-гранул.Научная новизнаВпервые установлено, что полноразмерный белок SBR (Dm NXF1)формирует зоны преимущественной локализации в ткани мозга, маркируяопределенные нейробласты и их потомков в личиночном периоде развития, атакже присутствует в составе РНП-гранул в отростках нейронов. Впервыепоказано, что нарушение поведения и способности к отрицательному геотаксису усамцов, несущих аллель sbr12 в гетерозиготе, ассоциировано с дефектамиформирования некоторых функциональных центров мозга – эллипсоидного тела имедуллы, а также с увеличением уровня нейродегенерации.
У самокфенотипическое проявление присутствия аллеля sbr12 в гетерозиготе выраженослабее и проявляется с возрастом. Впервые установлено, что дефектыформирования медуллы у самцов, несущих аллель sbr12 в гетерозиготе, связаны снарушением роста и терминации аксонов фоторецепторных нейронов исопровождается повышенным уровнем нейродегенерации уже на личиночнойстадии развития.Теоретическая и практическая значимостьИзучение тканеспецифичных функций эволюционно консервативного генаsbr (nxf1) у D. melanogaster вносит вклад в фундаментальное представление оспособах и распространённости тканеспецифичной регуляции экспрессии геновна посттранскрипционном уровне, ставит вопрос о роли продуктов гена nxf1 вформировании и функционировании нервной системы, демонстрирует связьмежду процессами транскрипции, экспорта мРНК и трансляции через участиеРНК-связывающих белков в этих процессах.
Наличие специализированныхфункций у альтернативных продуктов гена sbr свидетельствуют обэволюционном многообразии путей реализации аналогичных задач намолекулярном уровне у представителей разных таксонов. Полученные в работерезультаты способствуют пониманию механизмов, лежащих в основеформирования дефектов структуры мозга и поведения.Все описанные закономерности могут быть использованы в молекулярногенетических курсах как иллюстративный материал.Методология и методы исследованияВ работе использованы методы: культивирование линий D. melanogaster,получение особей нужных генотипов путём постановки скрещиваний;препарирование органов на различных стадиях развития (мозг личинок первоговозраста, глазо-антеннальные имагинальные диски и мозг личинок третьеговозраста, мозг имаго); иммуногистохимическая окраска органов; приготовлениепарафиновых срезов голов имаго, окрашенных гематоксилином-эозином; анализпрепаратов при помощи световой и лазерной сканирующей конфокальноймикроскопии; методы статистического анализа.Положения, выносимые на защиту1.Присутствие белка SBR12 оказывает доминантно-негативное влияние наповедение гетерозиготных самцов D.
melanogaster и формирование у нихопределенных нервных центров;2.Белок SBR в составе транспортных нейрональных РНП-гранул участвует вцитоплазматическом транспорте определенных мРНК-мишеней;3.Ген sbr важен для роста и навигации аксонов ряда нейронов, чтонеобходимо для корректного формирования соответствующих нервныхцентров мозга D. melanogaster.Степень достоверности и апробация результатовДостоверность результатов подтверждается их воспроизводимостью внезависимых экспериментах и включением в работу дополнительныхконтрольных групп. По материалам диссертации опубликовано 12 работ: 4 статьив реферируемых научных журналах и в коллективной монографии и 8 тезисов.Изложенные в диссертации результаты были представлены на четырёхотечественных и четырёх зарубежных научных конференциях.Объем и структура работыДиссертация изложена на 155 страницах и состоит из введения, четырехразделов, заключения, выводов и списка литературы, который включает 324источника.
Рукопись содержит 59 рисунков и 4 таблицы.МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫЛинии D. melanogaster: Oregon-R (дикий тип); sbr12 (l(1)24/45) / FM6v, y sc8dm B (рецессивный летальный аллель sbr12 находится в Х-хромосоме); Df(1)v-L4,ras2 mD / FM6l, y sc8 dm B / Dp(1;Y) y+ v+ (рецессивный летальный аллель L4 –делеция всего гена sbr в Х-хромосоме на фоне аллеля sbr+, присутствующего всоставе участка Х-хромосомы, перенесенного в Y-хромосому). Для краткости,далее по тексту присутствие аллеля sbr+ в Y-хромосоме у самцов в составедупликации Dp(1;Y) y+ v+ обозначаем как «Dp(1;Y)».Обоснование выбора генотиповУ самцов дикого типа присутствует только одна доза аллеля sbr+ - в Ххромосоме.
У самцов sbr12/Dp(1;Y), помимо аллеля sbr12 в Х-хромосоме,присутствует еще и аллель sbr+, локализованый в Y-хромосоме. В результате утаких самцов изменяется как доза гена sbr, так и хромосомная локализация аллеляsbr+. Поэтому в исследование в качестве дополнительных контрольных группвзяты и самцы sbr+/Dp(1;Y), имеющие 2 дозы аллеля sbr+ (в Х- и в Y-хромосоме),и самцы L4/Dp(1;Y), единственный аллель sbr+ у которых локализован в Yхромосоме.
У самок: помимо самок дикого типа и самок sbr12/sbr+, в исследованиевключены и самки L4/sbr+, несущие только один аллель sbr+ в одной из Ххромосом.Оценка активности мух в тесте на отрицательный геотаксисЭксперименты проводили по стандартной методике (Feany and Bender,2000), учитывая долю «активных» особей (поднявшихся выше тестовой отметки)и «неактивных» особей (оставшихся на дне сосуда) через 1 минуту послемеханической стимуляции двигательной активности мух путем стряхивания их надно сосуда и обусловленной отрицательным геотаксисом.Приготовление препаратовИспользовали 2 подхода: приготовление парафиновых срезов голов,окрашенных гематоксилином-эозином (срезы голов взрослых мух готовила С.ИТимошенко (ПИЯФ), по стандартной методике: Кисели, 1962) – для анализаструктуры мозга у учета нейродегенеративных повреждений, а такжеприготовление иммуногистохимически (ИГХ) окрашенных препаратов (мозгличинок и имаго, глазо-антеннальные имагинальные диски личинок 3-го возраста)– для анализа структуры мозга, характера расположения аксоновфоторецепторных нейронов и особенностей локализации белка SBR (DmNXF1) вклетках.
Для ИГХ окраски использовали первичные антитела к белкам: HRP,Bruchpilot, SBR, dFMR1 и ELAV, а также соответствующие им вторичныеантитела, конъюгированные с различными флуорохромами. Ядра клетококрашивали при помощи DAPI. ИГХ окраску органов проводили согласностандартной методике (Henderson, 2004) c незначительными изменениями.Анализ препаратов проводили с использованием световой и лазернойсканирующей конфокальной микроскопии.Статистическая обработка результатов проведена с использованиемнепараметрических критериев: тест Краскелла-Уоллиса для множественныхсравнений, U-критерий Манна-Уитни – для попарных сравнений.РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ3.1Влияние аллеля sbr12 на возрастную динамику активности самцов исамок различных генотипов в тесте на отрицательный геотаксисВзрослые D. melanogaster характеризуются отрицательным геотаксисом(ОГТ): мухи инстинктивно стремятся расположиться в верхней части ёмкости, вкоторой содержатся, и при стимулировании их двигательной активностистряхиванием – поднимаются по стенкам вверх со скоростью, соответствующейуровню их локомоторной активности.
Поскольку самцы, несущие аллель sbr12 вгетерозиготе, большую часть времени проводят на дне сосуда, для оценкипоказателей активности мух был выбран тест на ОГТ. В эксперимент взяты самцыи самки 4 возрастных групп: 3-5 суток, 7-9 суток, 11-13 суток и 15-17 суток.Особей в возрасте более 17 суток не тестировали, поскольку большинство самцовsbr12/Dp(1;Y), характеризующихся наиболее выраженным проявлением аллеляsbr12, к этому времени погибает.Согласно полученным нами результатам, увеличение дозы гена sbr сверхнормы не оказывает существенного влияния на активность самцов sbr+/Dp(1;Y) втесте на ОГТ: доля активных особей среди таких самцов и самцов дикого типа(линия Oregon-R) превышает 60% (Рис. 1А).
Снижение доли активных в тесте наОГТ особей среди гетерозиготных самцов sbr12/Dp(1;Y) и самцов L4/Dp(1;Y),единственный аллель sbr+ у которых локализован в Y-хромосоме, наблюдаетсяуже в возрасте 3-5 суток (до 13.7% и 50.1%, соответственно), и более выражено усамцов sbr12/Dp(1;Y). К возрасту 15-17 суток доли активных особей в тесте наОГТ среди самцов sbr12/Dp(1;Y) и L4/Dp(1;Y) снижаются до 10.3% и 25.5%,соответственно, и становятся статистически неразличимыми (Рис. 1А).Сходная картина наблюдается и у самок, но проявляется с возрастом (Рис.1Б): начиная с возраста 7-9 суток, доля активных в тесте на ОГТ особей средиРисунок 1. Доля активных в тесте на ОГТ особей среди самцов (А) и самок (Б)различных генотипов в зависимости от возраста.
Ось Y – доля активных особей, осьХ – возраст. Статистически значимые отличия отмечены звёздочками.самок sbr12/sbr+ статистически значимо (p<0.01) снижена относительно таковой усамок других генотипов: дикого типа (несут две дозы аллеля sbr+) и L4/sbr+,несущих только один аллель sbr+.
Доля активных в тесте на ОГТ особей средисамок L4/sbr+ статистически значимо (p<0.01) снижена относительно таковой усамок дикого типа только в возрастной категории 15-17 суток.Во всех возрастных категориях доля неактивных особей среди самцов+sbr /Dp(1;Y), несущих 2 дозы аллеля sbr+, и самцов дикого типа, в среднем непревышает 10%. Среди самцов sbr12/Dp(1;Y) и L4/Dp(1;Y) доля неактивных особейстатистически значимо выше (p<0.01) и увеличивается по мере взросления: от27.5% (3-5 суток) до 64.1% (15-17 суток) у самцов sbr12/Dp(1;Y) и от 14.4% до50.6%, соответственно, у самцов L4/Dp(1;Y). Доля неактивных в тесте на ОГТособей среди самок sbr12/sbr+ снижена относительно таковой у самок другихгенотипов начиная с возраста 10-13 суток (p<0.01).
Оба показателя активности усамок L4/sbr+ статистически значимо отличаются от таковых у самок другихгенотипов только в возрастной категории 15-17 суток.Полученные результаты указывают на то, что увеличение дозы гена sbr неоказывает существенного влияния на показатели активности самцов в тесте наОГТ. Присутствие аллеля sbr12 в гетерозиготе проявляется доминантно у особейобоих полов, но выражено значительно сильнее у самцов.Изменение хромосомной локализации аллеля sbr+ у самцов L4/Dp(1;Y) иуменьшение дозы аллеля sbr+ у самок L4/sbr+ оказывает влияние на показателиактивности, что свидетельствует, с одной стороны, о том, что уменьшение дозыгена sbr у самок отрицательно сказывается на показателях активности мух, а сдругой, на то, что наличие одной дозы аллеля sbr+ в Y-хромосоме у самцов неэквивалентно присутствию одной дозы этого аллеля в Х-хромосоме у самцовдикого типа.
В обоих случаях снижение доли активных и повышение долинеактивных в тесте на ОГТ особей выражено слабее, чем у носителей аллеля sbr12того же пола, что свидетельствует о доминантно-негативном эффекте продуктааллеля sbr12. Разница в проявлении аллелей sbr12 в гетерозиготе у особей разногопола может быть обусловлена тем, что аллель sbr+ у них имеет различнуюхромосомную локализацию (в X-хромосоме – у самок, в Y-хромосоме – у самцов),что может оказывать влияние на уровень экспрессии аллеля sbr+. С другойстороны, различия в фенотипическом проявлении аллеля sbr12 могут быть связаныс реализацией механизма дозовой компенсации, в результате чего у самцов D.melanogaster уровнь транскрипции аллеля sbr12, локализованного в единственнойХ-хромосоме, превышает таковой для этого аллеля в одной из Х-хромосом усамок.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
