Автореферат (1145636), страница 4
Текст из файла (страница 4)
Мы предположили, что белок SBR может сохранять связь вцитоплазме с определенными мРНК, важными для роста аксонов нейронов иформирования мозга в целом. Для проверки этого предположения мыпроанализировали характер расположения как белка SBR, так и белка dFMR1(известного компонента РНП-гранул) в нейронах (Рис. 5).Рисунок 4. Характер локализации белка SBR в кортексе полушария мозга самца D.melanogaster дикого типа на стадии личинки 3-го возраста.
Короткие стрелкиуказывают на клеточную линию, бедную белком SBR, длинные – на богатую этимбелком. Головкой стрелки отмечены формирующиеся вторичные аксональные тракты.Звездочкой отмечен нейробласт, богатый белком SBR, точкой – нейробласт, бедныйданным белком. Масштаб: 20 мкм.Рисунок 5. Гранулы, содержащие белки SBR и dFMR1, в отростках нейронов мозгаличинки D. melanogaster 1-го возраста. А. Нейроны мозга личинки D.
melanogaster; Б.Увеличенный фрагмент изображения, отмеченный рамкой на панели А. Ядра клетококрашены при помощи DAPI, белки SBR, dFMR1 и ELAV (маркирует ядра нейронов) –при помощи соответствующих антител. Стрелками показаны гранулы, содержащиебелок SBR; головками стрелок – гранулы, содержащая белок dFMR1. Масштаб: панельА – 10 мкм, панель Б – 1 мкм.Результаты эксперимента показали, что оба белка – и SBR, и dFMR1,выявляются в виде гранул в теле и отростках нейронов (Рис. 5А). Интересно, чтоданные белки обнаруживаются в гранулах как вместе, так и раздельно (Рис. 5Б).Существование гранул, в которых выявляются оба эти белка, указывают на то, чтобелок SBR входит в состав РНП-гранул и, по-видимому, участвует вцитоплазматическом транспорте мРНК по отросткам нейронов.
Наличие жегранул, содержащих только белок dFMR1, или только белок SBR, свидетельствуето том, что у белка SBR, как и у белка dFMR1, есть специфические мРНК-мишенив цитоплазме. В противном случае, белок SBR выявлялся бы во всех гранулах,содержащих белок dFMR1. Гранулы, обнаруживающие присутствие только белкаSBR, по-видимому, являются РНП-гранулами, не содержащими мРНК, длятранспорта которых необходим белок dFMR1. Таким образом, наличие белковSBR и dFMR1 в составе одной и той же гранулы подтверждает предложеннуюнами гипотезу о роли белка SBR (Dm NXF1) в транспорте мРНК по отросткамнейронов.
Существование гранул, содержащих только один из этих белков,позволяет предполагать участие белка SBR в цитоплазматической судьбе не всех,а только некоторых долгоживущих мРНК.Характер локализации белка SBR в клетках мозга наряду с существованиеммутаций гена sbr, приводящих к нарушению формирования и функционированиямозга, поднимают вопрос о молекулярных механизмах, определяющих роль генаsbr в этих процессах. Мутация sbr12 представляет собой делецию 30 нуклеотидовв экзоне 9, в результате чего в белке SBR12 отсутствует 10 аминокислот (Рис. 6,Mamon et al., 2017). Делеция изменяет структуру домена NTF2L (Гинанова, 2017),отвечающего за взаимодействие с белком NXT1 (p15), который являетсяпостоянным партнером NXF1 (Bachi et al., 2000; Fribourg et al., 2001).
Кроме того,домен NTF2L, как и домен UBA, обеспечивает взаимодействие белка NXF1 снуклеопоринами – белками ядерных поровых комплексов, и, соответственно,транспорт всей мРНП-частицы из ядра в цитоплазму (Fribourg et al., 2001; Braun etal., 2002).
Примечательно, что мутация sbr12 затрагивает только полноразмерныйбелок, в то время как короткий белок (продукт трансляции альтернативноготранскрипта с сохранённым интроном 5-6) не изменяется (Рис. 6).Рисунок 6. Доменная организация белка SBR. Условные обозначения: RBD — РНКсвязывающий домен; LRR — домен, богатый лейциновыми повторами; NTF2L —домен, похожий на белок NTF2 (nuclear transport factor 2); UBA — домен,ассоциированный с убиквитином. NLS – сигнал ядерной локализации.
Белок SBR-irпредставляет собой продукт трансляции альтернативного транскрипта с сохраненныминтроном 5 (на основе Mamon et al., 2017; с изменениями).Структура N-терминальных доменов белка SBR (Dm NXF1), отвечающихза взаимодействие с мРНК и белками-партнерами NXF1, в мутантном белке SBR12не изменена.
В N-терминальной части белка SBR (Dm NXF1) у дрозофилы, как иу млекопитающих, находится сигнал ядернoй локализации (Zhang et al., 2011),таким образом, белок SBR12 должен сохранять возможность перемещаться в ядро.Интересно, что в N-терминальной части белка NXF1 человека присутствует еще ипоследовательность олигомеризации, обеспечивающая взаимодействие белковNXF1 между собой.
Предполагают, что полноразмерный белок NXF1 человекаобразует такие димеры, взаимодействуя с коротким белком sNXF1 (от «short»),соответствующим интрон-содержащему транскрипту гена nxf1 (Li et al., 2006). Умыши короткий белок sNXF1, соответствующий интрон-содержащемутранскрипту, широко представлен в гиппокампе и неокортексе мозга (Li et al.,2016), в то время как синтез полноразмерного белка в нейронах гиппокампанаходится на низком уровне (Zhang et al., 2007).
Примечательно, что у крысименно в гиппокампе обнаружили транскрипт гена nxf1 с сохранённым интроном10, кодирующий белок sNXF1 (Cho et al., 2015).Учитывая эволюционную консервативность белков NXF1, можнопредположить способность к олигомеризации и для белков SBR (Dm NXF1),содержащих N-терминальную часть. У дрозофилы, как и у млекопитающих, тожеесть альтернативный укороченный белок – SBR-ir, являющийся продуктомтрансляции альтернативного транскрипта с сохраненным интроном 5.Исследования в нашей группе показали, что содержание этого транскрипта втканях головы взрослых дрозофил превышает содержание нормальносплайсированного транскрипта (Ivankova et al., 2010).
Позднее было показано, чтосуществование интрон-содержащего транскрипта является эволюционноконсервативной особенностью генов nxf1 у разных животных (Мамон и др., 2013;Mamon et al., 2013; Wang et al., 2015). По аналогии с позвоночными, интронсодержащий транскрипт гена sbr (Dm nxf1) может быть партнером белка SBR (DmNXF1) в цитоплазме, то есть, появление короткого белка, соответствующегоинтрон-содержащему транскрипту гена sbr, может зависеть от полноразмерногобелка SBR. Присутствие интрона в транскрипте может служить маркером,определяющим локализацию и регуляцию трансляции этого транскрипта вцитоплазме и, соответственно, регулировать появление короткого белка sNXF1(SBR-ir).
Формирование нервных центров определяется направленным ростомотростков нервных клеток, достижением ими своих мишеней, формированием иподдержанием синаптических контактов. Все названные процессы, в своюочередь, зависят от регулируемой трансляции особых долгоживущих мРНК,находящихся в составе комплексов РНП в состоянии, временно недоступном длятрансляции.
Компоненты комплексов РНП не однородны по своему составу как вотношении белков, так и РНК, и изучение составляющих элементов этих РНПкомплексов является важным этапом в понимании механизмов формирования ифункционирования нервной системы. Всё это определяет дальнейшиеперспективы исследования роли гена гена sbr (Dm nxf1) и соответствующего емутранскрипта с интроном, а также функций короткого белка SBR-ir иполноразмерного белка SBR в нейрогенезе, начатые в настоящей работе.ВЫВОДЫ1. Белок SBR выполняет специализированные цитоплазматические функции,важные для формирования и функционирования нервной системы Drosophilamelanogaster, присутствуя в виде гранул в отростках нервных клеток.2.
У самцов-имаго рецессивный летальный аллель sbr12, нарушающий ихполовое поведение, в гетерозиготном состоянии имеет доминантныефенотипические проявления: вызывает появление дефектов структурыотдельных нервных центров мозга и снижает активность особей в тесте наотрицательный геотаксис.3. У самок-носительниц аллеля sbr12 нет врожденных структурных нарушениймозга, а снижение их активности в тесте на отрицательный геотаксиспроявляется с возрастом.4. Присутствие единственного аллеля sbr+ у самцов только в Y-хромосоме невызывает дефектов формирования нервных центров и приводит к снижениюактивности в тесте на отрицательный геотаксис в меньшей степени, чем усамцов, гетерозиготных по аллелю sbr12.5. У гетерозиготных самок делеция гена sbr приводит к снижению показателейих активности в тесте на отрицательный геотаксис в возрасте, превышающем15 суток, и в меньшей степени, чем присутствие аллеля sbr12, не вызываядефектов формирования структуры нервных центров в мозге.6.
Структурные аномалии медуллы, выявляемые у взрослых самцов,гетерозиготных по аллелю sbr12, вызваны нарушением роста и терминацииаксонов фоторецепторных нейронов, а также нейродегенерацией,детектируемой уже на личиночной стадии развития.СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИСтатьи:1. Mamon L.A., Ginanova V.R., Kliver S.F., Yakimova A.O., Atsapkina A.A.,Golubkova E.V. 2017.
RNA-binding proteins of the NXF (nuclear export factor)family and their connection with the cytoskeleton. Cytoskeleton (Hoboken). No. 4,p. 161-169. doi: 10.1002/cm.213622. Yakimova, A.O., Pugacheva, O.M., Golubkova, E.V., Mamon L.A. Yakimova AO,Pugacheva OM, Golubkova EV, Mamon LA. 2016. Cytoplasmic localization ofSBR (Dm NXF1) protein and its zonal distribution in the ganglia of Drosophilamelanogaster larvae. Invert Neurosci. 16(3): 9. doi: 10.1007/s10158-016-0192-53. Mamon L.A., Kliver S.F., Prosovskaya A.O., Ginanova V.R., Golubkova Ye.V.2014.
The intron-containing transcript: an evolutionarily conserved characteristic ofthe genes orthologous to nxf1 (nuclear export factor 1). Russian Journal of Genetics:Applied Research, Vol. 4, No. 5, pp. 434–443. doi: 10.1134/S2079059714050104(версия на русском языке – Мамон Л.А., Кливер С.Ф., Просовская А.О.,Гинанова В.Р., Голубкова Е.В. 2013. Интрон-содержащий транскрипт эволюционно-консервативная особенность генов-ортологов nxf1 (nuclearexportfactor).Экологическаягенетика№11(3),с.3-13.doi:10.17816/ecogen1133-13).4. Golubkova E., Mamon L., Nikulina A., Merezhko M., Ginanova V.
and Evgen’evM. 2012. The Evolutionarily Conserved Family of Nuclear Export Factor (NXF) inDrosophila Melanogaster. Drosophila Melanogaster: Life Cycle, Genetics. NovaBiomedical Books, New-York, p. 63-82.Тезисы конференций:1. Голубкова Е.В., Гинанова В.Р., Якимова А.О., Ацапкина А.А., Кливер С.Ф.,Мамон Л.А. Фактор ядерного экспорта РНК (Dm NXF1) осуществляет связьмежду аппаратом транспорта РНК и цитоскелетом// Сборник тезисовВсероссийской конференции с международным участием «50 лет ВОГиС:успехи и перспективы» (Москва, 8-10 ноября 2016). Стр.
35.2. Гинанова В.Р., Якимова А.О., Кливер С.Ф., Ацапкина А.А., Голубкова Е.В.,Мамон Л.А. Фактор ядерного экспорта мРНК NXF1 в семенниках D.melanogaster имеет специфическую изоформу// Сборник тезисов 19-йМеждународнойПущинскойшколы-конференциимолодыхученых«БИОЛОГИЯ – НАУКА ХХI ВЕКА» (Пущино, 20 - 24 апреля 2015 г.). Стр.225.3. Ginanova V., Golubkova E., Prosovskaya A., Avanesyan E., Mamon L.Evolutionary intron retention in transcripts of nxf1 (nuclear export factor 1) gene//Abstracts of papers presented at the EMBO | EMBL Symposia: The Complex Life ofmRNA (Heidelberg, Germany, 5 – 8 октября 2014 г.) Р. 173.4.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
