Автореферат (1145636), страница 3
Текст из файла (страница 3)
Различается и компенсаторный эффект аллеля sbr+, который зависит от еголокализации (в Х- или Y-хромосоме). Как следствие, у самцов ожидается болеевысокое содержание мутантной формы белка – SBR12, относительно содержаниябелка дикого типа – SBR, по сравнению с самками.Поскольку в основе поведенческих дефектов могут лежать аномалииструктуры соответствующих нервных центров мозга, следующим этапом работыявляется исследование структуры мозга самцов и самок тестируемых генотипов.3.2 Аномалии структуры мозга и нейродегенерация у самцов sbr12/Dp(1;Y)Проведенный нами анализ структуры мозга на различных стадиях развитиявыявил серьёзные аномалии только у самцов sbr12/Dp(1;Y).
На стадии имаго утаких самцов, при сохранении общего плана строения мозга, существеннонарушена структура эллипсоидного тела (ЭТ, один из функциональных центровцентрального комплекса нейропилей мозга) и ламины и медуллы (нейропилейзрительных долей). ЭТ является главным контроллером локомоторного ибрачного поведения у дрозофилы (Strauss, 2002), а нейропили зрительных долейотвечают за первичную обработку и проведение поступающих зрительныхсигналов (Meinertzhagen and Hanson, 1993).ЭТ у самцов sbr12/Dp(1;Y) разомкнуто на вентральной стороне, и зачастуювыявляется в виде фрагмента (Рис. 2), что свидетельствует о нарушенииформирования этого нервного центра в процессе онтогенеза. ЭТ начинаетформироваться в личиночном периоде, и у личинок третьего возрастапредставляет собой набор межполушарных комиссур.
Активный морфогенез ЭТпроисходит в период метаморфоза: аксоны соответствующих нейронов образуютконнектом, принимающий форму тора (Young and Armstrong, 2010a). Известно,что мутации в ряде генов, кодирующих ассоциированные с цитоскелетом белки,приводят к формированию сходного фенотипа: ЭТ у таких мутантов разомкнутона вентральной стороне, что связывают с нарушением роста и нацеливанияаксонов нейронов (Boquet et al., 2000a,b). У самцов других генотипов (Рис.
2) и усамок дефекты структуры ЭТ не выявлены.Рисунок 2. Структура эллипсоидного тела у взрослых самцов различныхгенотипов. ЭТ отмечено стрелками. Только у самцов sbr12/Dp(1;Y) структура ЭТнарушена: вместо характерного тора («бублика») на препаратах видны фрагменты ЭТ.Стрелки указывают на ЭТ, места разрывов в структуре ЭТ у самцов sbr12/Dp(1;Y)отмечены звездочками.
Масштабная линейка: 50 мкм.Структура ламины и медуллы высоко упорядочена: аксоныфоторецепторных нейронов (ФрН, или R-нейронов) и сопутствующих имнейронов образуют в этих нейропилях функциональные единицы коннектома –картриджи. В связи с этим, на препаратах парафиновых срезов мозга в ламине имедулле хорошо видна ячеистая структура, образованная синаптическимикартриджами. При этом, аксоны нейронов R1-R6 оканчиваются в ламине, ааксоны R7-R8 – в медулле. Аномалии структуры нейропилей зрительных долейвыявлены только у самцов sbr12/Dp(1;Y) и включают в себя дефектыформирования границы между медуллой и ламиной, а также нарушениеархитектуры коннектома внутри этих нейропилей.
На Рис. 3 представленыизображения, полученные при помощи световой (А) и лазерной сканирующейконфокальной (Б, В) микроскопии окрашенных гематоксилином-эозиномпарафиновых срезов голов взрослых самцов различных генотипов.Рисунок 3. Структура медуллы у взрослых самцов различных генотипов. А –изображенияпарафиновыхсрезовголоввзрослыхсамцов,окрашенныхгематоксилином-эозином. Б – увеличенные изображения участков медуллы,выделенных рамками на панели А. В - детальные изображения структуры медуллысамцов sbr12/Dp(1;Y) с условными отметками, показывающими нарушение структурыграницы между медуллой и ламиной (вверху, граница показана точками) и аномалиямиформирования картриджей (внизу, картриджи отмечены звездочками, зона безкартриджей – стрелкой).
Масштаб: А – 75 мкм, Б – 25 мкм.Характер нарушения границы между ламиной и медуллой у самцовsbr /Dp(1;Y) указывает на то, что аксоны некоторых нейронов, которые должны12были оканчиваться в ламине, не нашли свои мишени и проросли глубже – вмедуллу (Рис. 3 Б, В). У самцов других генотипов и самок нарушения границымежду ламиной и медуллой не выявлены. Помимо дефектов границы, только усамцов sbr12/Dp(1;Y) в медулле (Рис. 3 Б, В) и ламине значительно нарушенхарактер расположения картриджей, вплоть до полного их отсутствия внекоторых областях.
Такой характер аномалий свидетельствует о нарушенииконтроля навигации и роста аксонов ФрН у самцов sbr12/Dp(1;Y). Примечательно,что в роли «пионерных» нейронов при формировании зрительного нервного путив медулле выступают фоторецепторные нейроны R7 и R8. Аксоны этих нейроновпервыми приходят в медуллу и служат навигационным ориентиром для аксоновдругих нейронов, участвующих в формировании синаптических картриджей (по:Apitz and Salecker, 2014).Помимо дефектов формирования структуры нервных центров, в мозгесамцов sbr12/Dp(1;Y) повышен уровень нейродегенерации уже в возрасте 3-5суток. У самцов других генотипов и самок доля поврежденной ткани в этомвозрасте в среднем составляет 0.1% от объёма мозга, в то время, как у самцовsbr12/Dp(1;Y) этот показатель статистически значимо (p<0.05) выше, и в среднемсоставляет 1.4% от объема мозга.
Обращает на себя внимание тот факт, чтобольшая часть нейродегенеративных повреждений в мозге самцов sbr12/Dp(1;Y)располагается в зрительных долях, включая ламину и медуллу – именно в этихнейропилях у самцов sbr12/Dp(1;Y) можно видеть наиболее значительныеаномалии роста и навигации аксонов нейронов. Это согласуется с известнымиданными об оптимизации коннектома при формировании мозга: нейроны и ихотростки, не достигшие своих мишеней, элиминируются (Yamaguchi and Miura,2015a).Такимобразом,преимущественноерасположениеочагов12нейродегенерации в ламине и медулле у самцов sbr /Dp(1;Y) может бытьобусловлено гибелью нейронов и/или локальной элиминацией отростковнейронов, не нашедших свои мишени при формировании зрительного пути.
Дляпроверки этого предположения мы проанализировали структуру формирующейсямедуллы в мозге личинок третьего возраста. Среди самцов и самок всехтестированных генотипов, только у самцов sbr12/Dp(1;Y) в нейропиле медуллывыявляются пустоты, что указывает на нейродегенерацию. Таким образом,причиной структурных аномалий ламины и медуллы у самцов sbr12/Dp(1;Y)является не только нарушение навигации и роста аксонов нейронов, но инейродегенерация, детектируемая уже в процессе формирования мозга – наличиночной стадии развития.Отсутствие видимых нарушений формирования ЭТ и зрительных долеймозга у самцов L4/Dp(1;Y), единственный аллель sbr+ у которых локализован в Yхромосоме, наряду со снижением среди таких самцов доли активных в тесте наОГТ особей уже в возрасте 3-5 суток, свидетельствует о том, что уровеньэкспрессии аллеля sbr+, находящегося в Y-хромосоме у таких самцов, являетсядостаточным для нормального формирования, но недостаточным дляполноценного функционирования нервной системы.
В то же время, нарушенияструктуры мозга и значительно более выраженное снижение доли активных втесте на ОГТ особей среди самцов sbr12/Dp(1;Y) указывает на то, что эти эффектывызваны именно доминантным проявлением аллеля sbr12.Дефекты формирования определенных нервных центров в мозге самцов,несущих аллель sbr12 в гетерозиготе, поднимают вопрос о механизмах, лежащих вих основе. Такие нарушения невозможно объяснить одним лишь снижениемобщего уровня экспорта мРНК в результате нарушения универсальной функции –ядерно-цитоплазматического экспорта мРНК, осуществляемого белком SBR. Дляпроверки предположения о том, может ли белок SBR выполнятьспециализированные функции в цитоплазме в составе комплексов РНП, участвуяв биогенезе долгоживущих мРНК, мы проанализировали характер локализацииэтого белка в клетках мозга в динамике личиночного развития.
Посколькупроцесс формирования нервных центров мозга имаго начинается в периодразвития личинки, именно личиночный этап онтогенеза был выбран нами дляисследования характера локализации белка SBR в развивающемся мозге.3.2 Особенности локализации белка SBR в развивающемся мозге уличинок D. melanogasterБелок SBR (Dm NXF1) обеспечивает экспорт большинства мРНК из ядра вцитоплазму клетки в составе рибонуклеопротеиновых (РНП) комплексов(Delaleau and Borden, 2015). В большинстве клеток у различных организмов, атакже в культурах клеток, ортологи NXF1 выявляются в ядре и вблизи ядернойоболочки, что соответствует их функции (Braun et al., 2002).Мы впервые показали, что в развивающемся мозге личинок D.
melanogasterбелок SBR распределяется неравномерно, формируя зоны преимущественнойлокализации. Такие зоны образуют активные нейробласты и ближайшие к нимклетки – вероятно, их потомки (Рис. 4). В этих зонах белок SBR присутствует нетолько в ядрах и вблизи ядерной оболочки клеток, но главным образомвыявляется в виде крупных гранул в цитоплазме. Интересно, что если вцитоплазме НБ белка SBR много, то и его дочерние клетки обогащены этимбелком, и наоборот. Следует отметить, что каждый нейробласт у дрозофилыуникален, имеет свой паттерн экспрессии генов и образует определенноеколичество потомков определенного типа (Urbach and Technau, 2003; Egger et al.,2008). По-видимому, белок SBR проявляет специфичность не ко всем, а только кнекоторым клеточным линиям, что согласуется с фенотипическим проявлениемаллеля sbr12 у самцов: в их мозге нарушена структура, преимущественно,определенных нервных центров.Важно отметить, что вне зависимости от того, обогащена ли конкретнаяклеточная линия белком SBR, этот белок маркирует формирующиеся вторичныеаксональные тракты – пучки аксонов нейронов, являющихся потомками одного итого же нейробласта.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
