Диссертация (1144791), страница 33
Текст из файла (страница 33)
с соавт., 2014;Xing B. et al., 2008; Ding Z.M. et al., 2012; Zamani M. et al., 2013; Wang P.F. et al.,2014). Так, при использовании 4-сосудистой методики моделирования глобальнойишемии головного мозга у крыс Wistar, было установлено, что 10-минутнаяишемия с последующей реперфузией длительностью 3 сут приводила кзначимому снижению экспрессии белка Bcl-2 в нейронах поля СА1 гиппокампа;при этом анализ экспрессии Bcl-2 проводился путем Вестерн-блоттинга (DingZ.M. et al., 2012). В исследовании на мышах также было показано, что 15минутная ишемия головного мозга с последующим реперфузионным периодомдлительностью 7 сут приводит к уменьшению экспрессии белка Bcl-2 в поле СА1гиппокампа по данным Вестерн-блоттинга (Zamani M.
et al., 2013). Примоделировании фокальной ишемии головного мозга у крыс Sprague-Dawley179длительностью60минутспоследующейреперфузией24часа,вгомогенизированных образцах коры мозга поврежденного полушария, используяметодику Вестерн-блоттинга, было установлено значимое понижение экспрессиибелка Bcl-2 (Xing B. et al., 2008). Аналогичные результаты по понижениюэкспрессии белка Bcl-2, используя методику Вестерн-блоттинга, были получены висследовании на мышах, у которых моделировали фокальную 60-минутнуюишемию мозга с последующим 48-часовым периодом реперфузии (Wang P.F. etal., 2014).
Увеличение экспрессии мРНК гена bcl-2 после моделирования 15минутной глобальной ишемии мозга у крыс Sprague–Dawley было установленодля разных полей гиппокампа, причем наибольшее увеличение было характернодля поля СА1, затем следовал слой гранулярных клеток зубчатой извилиныгиппокампа и далее пирамидные нейроны поля СА3 гиппокампа. При этомдлительность пика экспрессии мРНК гена bcl-2 для поля СА1 длилась 48 часов,начиная с 24 часов и заканчивая 72 часами реперфузии, а для нейронов поля СА3и клеток зубчатой извилины гиппокампа составляла всего 24 часа.
Однако прииммуногистохимическом анализе наибольший уровень экспрессии белка Bcl-2был установлен для поля СА3 и клеток зубчатой извилины гиппокампа винтервале от 24 до 72 часов постишемической реперфузии (Chen J. et al., 1998).Уменьшение интенсивности реакции на белок Bcl-2 было обнаружено в поле СА1гиппокампа монгольских песчанок после моделирования 5-минутной ишемииголовного мозга (Shimazaki K. et al., 1994). Понижение экспрессии белка Bcl-2было установлено методом количественной иммуногистохимии в поле СА1гиппокампа у крыс, переживших тяжелую гипоксию (Ветровой О.В. с соавт.,2014). Полученные нами результаты, а также результаты других исследований непротиворечат сведениям об ингибировании белкового синтеза вследствиетяжелой ишемии (Vass K.
et al., 1988; Kiessling M. et al., 1993). Существуют ипротивоположные данные об экспрессии белка Bcl-2 (Hara A. et al., 1998; ZhangQ.G. et al., 2009 Nemethova M. et al., 2010). В исследовании, проведенном намонгольских песчанках, было установлено, что при 5-минутной ишемииголовного мозга и последующей реперфузии в течение 4 сут, а также у180ложнооперированных животных Bcl-2–позитивные нейроны в поле СА1 необнаруживались, в то время как при применении ингибитора протеаз,участвующихвапоптозе,N-тосил-L-фенилаланилхлорметилкетоно-иммунореактивные нейроны выявлялись (Hara A.
et al., 1998). В исследовании накрысах Wistar с использованием 4-сосудистой методики моделированияглобальной ишемии головного мозга было установлено, что 8-минутная ишемия споследующей реперфузией длительностью 3 сут. приводила к значимомуповышению экспрессии белка Bcl-2 в поле СА1 и зубчатой извилине гиппокампа,верифицированному иммуногистохимически (Nemethova M. et al., 2010). Можнопредположить, что в упомянутом исследовании при анализе учитывались нетолько морфологические неизмененные нейроны поля СА1 гиппокампа.
Прииспользовании 4-сосудистой методики моделирования 8-минутной глобальнойишемии головного мозга у крыс Sprague–Dawley методом иммуногистохимиибыла выявлена активность экспрессии белка Bcl-2 в поле СА1 гиппокампа кконцу 3-х суток реперфузионного периода. При этом различий в экспрессии белкау ложнооперированных крыс, и крыс, перенесших ишемию, обнаружено не было(Zhang Q.G. et al., 2009).
Авторами не было указано, измерялся ли уровеньэкспрессии белка Bcl-2 в морфологически неизмененных нейронах поля СА1гиппокампа, срез которых проходил через ядрышко, как это было предложеноделать для стандартизации морфологического анализа (Kirino T., 1982). Еще водномисследованииметодомВестерн-блоттингаанализировалиуровеньэкспрессии белка Bcl-2 в поле СА1 гиппокампа через 6, 24 и 72 часа послемоделирования 5-минутной глобальной ишемии головного мозга у песчанок,однако различия в уровне белка были минимальными (Antonawich F.J. et al.,1998).Существованиеиспользованиемпротиворечивыхразличныхметодикрезультатовмоделированияможнообъяснитьишемии-реперфузииголовного мозга, различными временными точками анализа уровня экспрессиибелка, использованием различных видов экспериментального инфаркта головногомозга, а также разнообразных методик детекции и реактивов.
Также следуетупомянуть, что ген bcl-2 является достаточно хорошо изученным геном у181грызунов. У них описано несколько различных транскриптов, которые имеютодну и ту же открытую рамку считывания и кодируют один и тот же белок(Castren E. et al., 1994). Существующие различия в длине транскриптаобъясняются полиморфизмом гена в нетранслируемой области мРНК гена bcl-2,характерной для тканей различных видов и линий животных (Negrini M.
et al.,1987; Castren E. et al., 1994).Применениеишемическихпосткондиционирующихстимуловпослеобратимой повреждающей ишемии головного мозга у крыс и монгольскихпесчанок приводило к увеличению уровня экспрессии белка Bcl-2 в цитоплазмеморфологически неизмененных нейронов в анализируемых слоях коры мозга инейронов полей гиппокампа при сравнении с аналогичными данными в группахбез применения ИПостК. При этом наибольшая степень повышения уровняэкспрессии белка Bcl-2 отмечалась в раннем реперфузионном периоде, т.е. ко 2-мсуткам реперфузионного периода.
Можно предположить, что наибольший пикметаболической активности ИПостК, влияющий на уровень экспрессии белка Bcl2 в нейронах коры головного мозга и полей гиппокампа реализуется в раннийреперфузионный период. В отдаленном реперфузионном периоде у песчанокотмечалось повышение уровня белка Bcl-2 в цитоплазме неизмененных нейроновв наиболее чувствительном к ишемии поле СА1 и в нейронах слоя V корыголовного мозга, в то время как у крыс отмечалось повышение во всеханализируемых слоях коры головного мозга и в полях СА1, СА2 и СА3гиппокампа при сравнении с таковым в соответствующих группах животных, нобез применения ИПостК. В раннем реперфузионном периоде после примененияИПостК повышение экспрессии белка Bcl-2 в нейронах было различной степени,а распределение нейронов внутри слоев мозга и полей гиппокампа в зависимостиот уровня экспрессии существенным образом отличалось от распределения,наблюдаемого у ложнооперированных животных.
В отдаленный реперфузионныйпериод, после применения ИПостК распределение нейронов внутри отдельныхструктур головного мозга в зависимости от уровня экспрессии белка Bcl-2соответствовалораспределению,наблюдаемомууложнооперированных182животных. Полученные нами результаты об увеличении уровня экспрессии белкаBcl-2 согласуются с данными исследований, проведенных с использованиемдругих методик и протоколов моделирования ИПостК.
Так, при фокальной 60минутной ишемии головного мозга у крыс Sprague–Dawley применение 6эпизодов ишемии-реперфузии по 30 с к 24 ч реперфузии способствовалоуменьшению объема повреждения и приводило к увеличению уровня белка Bcl-2,выявленного при помощи Вестерн-блоттинга в пораженном полушарии.
(Xing B.et al., 2008). Тем же методом было установлено, что применение ИПостК приглобальной ишемии головного мозга у крыс приводит к увеличению экспрессиибелка Bcl-2 и числа жизнеспособных нейронов в поле СА1 (Ding Z.M. et al. 2012).Однако в указанных выше исследованиях экспрессию белка Bcl-2 измеряли вгомогенате структур головного мозга, и такой подход не позволяет судить ометаболическихизменениях,происходящихнепосредственновнейронахотдельных структур головного мозга, и не позволяет оценить вклад ИПостК визменение содержания белка в нейронах.
Известно, что клетки глии в ответ надействие ишемии-реперфузии также реагируют изменением уровня экспрессиибелка Bcl-2 (Merry D.E. et al., 1994). Существуют только единичныеисследования, направленные на изучение изменения уровня экспрессии белкаBcl-2 непосредственно в цитоплазме нейронов. Так, методом количественнойиммуногистохимии было показано, что 3 сеанса ИПостК, вызванных умереннойгипобарической гипоксией, после тяжелой гипоксии приводят к увеличениюэкспрессии белка Bcl-2 в цитоплазме выживших нейронов (Ветровой О.В. ссоавт., 2014). Однако существует исследование, показывающее уменьшениеэкспрессии белка Bcl-2 в поле СА1 у крыс после применения ИПостК на моделиглобальной ишемии головного мозга (Nemethova M. et al., 2010). Авторы работыне указали, обладал ли примененный протокол ИПостК цитопротективнымэффектом для поля СА1 гиппокампа.
Известно, что протоколы примененияИПостК, в зависимости от длительности и частоты применяемых стимулов,исследователиразрабатываютвходеэкспериментальногоисследования,основываясь, в основном, на результатах морфометрии, с последующим183изучением нейропротективных механизмов, реализующихся при примененииИПостК.Нами показано, что у крыс и песчанок монгольских ишемическиепосткондиционирующие стимулы, выполненные непосредственно после ишемиив периодах ранней и отдаленной реперфузии, способствуют увеличению синтезабелка Bcl-2 в нейронах слоев II, III и V коры и полей СА1, СА2, СА3 и СА4гиппокампа, обладающих разной устойчивостью к повреждающему действиюишемии-реперфузии.
При этом наибольшая степень повышения экспрессии белкаBcl-2 при применении ИПостК в раннем и отдаленном реперфузионном периодебыла характерна для самых чувствительных к ишемии нейронов головного мозга– нейронов поля СА1 гиппокампа у песчанок и нейронов полей СА1 и СА3 укрыс, что позволяет сделать вывод о том, что в механизмы цитопротекции приИПостК вовлекается белок Bcl-2.
Следует отметить, что достоверное уменьшениеморфологически неизмененных нейронов в поле СА4 гиппокампа у крыс ипесчанок наблюдалось только к 7-м суткам реперфузионного периода, при этомприменение ИПостК приводило к выраженному цитопротективному эффекту,который не сопровождался значимым увеличением экспрессии белка Bcl-2. Вдругих областях головного мозга отмечалось повышение уровня экспрессиибелка Bcl-2 при применении ИПостК, но оно не всегда было связано сизменением числа морфологически неизмененных нейронов. Наблюдаемыеизменения могут объясняться развитием компенсаторно-восстановительныхреакций для защиты целой отдельной структуры мозга в пределах всегоголовного мозга, т.е.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
