Автореферат (1144751), страница 6
Текст из файла (страница 6)
Напротив, в ответ на инокуляцию на ранних стадиях развитиясимбиоза (1 – 3 дпи) в корнях гороха уровень экспрессии гена PIN3 существенноснижался, а экспрессия генов PIN2 и PIN4 увеличивалась (рисунок 15). Экспрессиядругих генов PIN мало менялась в процессе развития симбиоза.Полученные данные о подавлении уровня экспрессии гена PIN3, а такжеувеличении экспрессии генов PIN2 и PIN4, контролирующих транспорт ауксинов угороха, соответствовали представлению о том, что у бобовых растений,формирующих клубеньки недетерминированного типа, временно нарушаетсяполярный транспорт ауксинов в ответ на инокуляцию, и ауксины накапливаетсялокально в клетках внутренней коры (Mathesius et al., 1998; De Billy et al., 2001;21Wasson et al., 2006; Huo et al., 2006).
Мы полагаем, что PIN3 у гороха можетконтролировать базипетальный транспорт, тогда как PIN2 и PIN4 - латеральныйтранспорт ауксинов.Рисунок 15. Анализ экспрессии генов PsPIN2, 3, 4, контролирующих транспортауксинов у гороха. К – контроль, дпи – дни после инокуляции.3.5. Анализ взаимодействия между компонентами сигнального каскада,активируемого Nod-факторами, и регуляторами фитогормонального ответа.Мы показали, что изменения в содержании цитокининов и активация рецептора кцитокининам могут происходить на нескольких этапах развития симбиоза у гороха.На ранних стадиях развития симбиоза увеличение содержания цитокининовпроисходит одновременно с изменением экспрессии генов PIN, контролирующихтранспорт ауксинов. Это может быть связано с взаимным влиянием гормоновцитокининов и ауксинов.
Неслучайно анализ мутанта люцерны слабоусеченнойcre1 с нарушением рецепции цитокининов показал, что у него отсутствуетингибирование ПАТ и перераспределение белков PIN в ответ на инокуляцию (Pletet al., 2011). Следовательно, на ранних этапах развития симбиоза цитокинины могутоказывать влияние на экспрессию генов PIN, контролирующих транспорт ауксинов.Сходное влияние цитокининов на экспрессию и распределение белков PINнаблюдается при формировании других латеральных органов у растений – боковыхкорней (Laplaze et al., 2007; Dello Ioio et al., 2008). Известно, что при добавленииэкзогенного цитокинина БАП или усилении экспрессии генов IPT происходитвидоизменение примордия бокового корня – он уплощается.
При этом БАП влияетна экспрессию генов PIN, что приводит к локальному изменению распределенияауксинов (Laplaze et al., 2007). Следовательно, на начальных этапах появленияклубеньков у бобовых растений, формирующих клубеньки недетерминированноготипа, могут работать механизмы, которые вовлечены в контроль органогенезабоковых корней.Для выяснения вопроса о том, к каким изменениям может приводитьувеличение содержания цитокининов в процессе развития клубеньков, былииспользованы растения исходной линии SGE и полученные на их основе Nodмутанты по генам sym7 (SGENod- -6), sym35 (SGENod- -1), а также неэффективныеFix- мутанты по генам sym33 (SGEFix- -2, SGEFix- -5) и sym40 (SGEFix- -1).В процессе развития клубеньков у растений исходной линии SGE возрасталаэкспрессия генов PsIPT1, 3, 4 и PsLOG1, 2, 4, 5, а также маркеров цитокининовогоответа PsRR4, 8 и 11, начиная с 7 дпи.
Анализ показал, что у формирующихклубеньки Fix- мутантов гороха по гену sym33 (SGEFix--5, SGEFix--2) на 7 дпиувеличивались уровни экспрессии двух генов PsIPT1, PsIPT4, а также PsRR4 и22PsRR8, являющихся маркерами активации рецептора к цитокининам (рисунок 16).Напротив, у Nod- мутантов гороха по генам sym7 и sym35 в ответ на инокуляцию (7дпи) экспрессия генов, контролирующих биосинтез цитокининов (PsIPT1, 3, 4 иPsLOG1, 2, 4, 5) и ответ растений на цитокинины (PsRR4, PsRR8 и PsRR11), неувеличивалась. Это показывает необходимость синтеза цитокининов дляформирования клубеньков, поскольку у мутантов по генам sym7 и sym35, у которыхгены IPT и LOG не активируются, органогенез клубеньков нарушен.Рисунок 16. Анализ экспрессии генов IPT1, IPT3, IPT4 и RR8 у растений горохадикого типа SGE и Nod- и Fix- мутантов SGENod--6 (sym7), SGEFix--5 (sym33) иSGENod--1 (sym35) в ответ на инокуляцию Rlv CIAM 1026 на 7 дпи.К 14 дпи в клубеньках мутанта по гену sym33 SGEFix--2 и SGEFix--5 неувеличивалась экспрессия генов PsIPT3, PsLOG1, 2, 4, 5, а также PsRR11 (рисунок17).
Клубеньки мутантов по гену sym33 остаются неинфицированными, посколькусодержат «запертые» инфекционные нити, из которых не наблюдается выходбактерий в цитоплазму растительной клетки (Voroshilova et al., 2009). Такимобразом, с выходом бактерий из инфекционных нитей в клетки коры корня иразвитием инфекционного процесса может быть связана дополнительная активациярецептора к цитокининам.Рисунок 17.
Анализ экспрессии генов PsIPT1, PsIPT4, PsLOG1, PsRR8 и PsRR11у растений гороха дикого типа SGE и мутантов SGEFix--5 (sym33), SGEFix- -1(sym40) при инокуляции Rlv CIAM 1026 (14 дпи).Для проверки данного предположения нами был дополнительно проведен23анализ мутанта гороха по гену sym40 SGEFix- -1, у которого нарушены процессыинфицирования клубеньков и дифференцировки.
У мутанта sym40 формируютсягипертрофированные инфекционные нити, однако выход бактерий изинфекционных нитей происходит, хотя и с задержкой по времени (Voroshilova et al.,2009). В отличие от мутантов по гену sym33 в клубеньках мутанта по гену sym40нами было выявлено увеличение экспрессии генов IPT3 и LOG1, 2, 4 и 5, а такжеRR11.Таким образом, анализ мутантов с нарушением способности формироватьклубеньки (Nod- фенотип) показал, что стимуляция рецептора к цитокинам прираспространении сигнала от Nod-фактора зависит от биосинтеза этих гормонов всамом растении за счет ферментов IPT и LOG. Было установлено, что отсутствиеспособности формировать клубеньки у Nod- мутантов гороха коррелирует сотсутствием активации ряда генов биосинтеза цитокининов IPT и LOG, чтоподтверждаетважностьсинтезацитокининовврастенияхдляклубенькообразования. У формирующего клубеньки мутанта sym33 наблюдалиувеличение экспрессии генов PsIPT1 и PsIPT4.
Однако отсутствие индукции PsIPT3и PsLOG1, 2, 4, 5 генов, а также PsRR11 у этого мутанта демонстрирует, что свыходом бактерий из инфекционных нитей может быть связана дополнительнаяактивация рецептора к цитокининам у гороха. Активацию этих генов наблюдали умутанта по гену sym40, у которого происходит инфекция клубеньков, но нарушеныдальнейшие этапы дифференцировки бактероидов.3.6. Локализация ответа на ауксины и цитокинины у мутантов гороха SGEFix-2 (sym33) с помощью репортерных конструкций DR5::GFP-NLS и pRR4::GUS.В связи с выявленными нами отличиями в экспрессии генов биосинтезацитокининов у мутантов по гену sym33 (SGEFix--2 и SGEFix--5), необходимо былодополнительно провести у них анализ распределения фитогормонов цитокининов иауксинов. У трансгенных растений SGEFix--2, содержащих генетическиеконструкции DR5::GFP и pRR4::GUS, нами были выявлены существенныеизменения в распределении ауксинов и цитокининов по сравнению с растениямиисходной линии SGE на 14 дпи.
Значительно более сильный ответ на ауксины былвыявлен в клубеньках мутанта SGEFix--2 (рисунок 18a). При этом ответ былравномерно распределен по всему клубеньку в отличие от растений исходнойлинии SGE. Вероятно, высокий уровень ауксинов у мутанта приводил к тому, чтопроцессы дифференцировки тканей клубеньков нарушались.Рисунок 18. Локализация ответа на ауксины и цитокинины в клубенькахмутанта SGEFix−-2, содержащих ауксин- и цитокинин-регулируемыеконструкции DR5::GFP-NSL (А) и pRR4::GUS (Б). Ответ на цитокинины был связанс проводящими пучками, меристемой и центральной зоной клубенька, где происходитвыход бактерий.24Напротив, зона локализации ответа на цитокинины была значительноредуцирована у мутанта SGEFix--2 (sym33) по сравнению с растениями исходнойлинии SGE (рисунок 18б). В отличие от мутанта SGEFix--5, в отдельных клубенькахмутанта SGEFix--2 может наблюдаться выход бактерий из инфекционных нитей вцитоплазму клеток клубенька.
У мутанта по гену sym33 SGEFix--2 окрашиваниеGUS наблюдали только в меристеме, проводящих тканях и слабое окрашивание – втех зонах клубенька, где наблюдался выход бактерий из инфекционных нитей.Таким образом, изменения в биосинтезе и накоплении цитокининов иауксинов у мутантов гороха SGEFix--2 и SGEFix- -5 могут приводить к нарушениямразвития симбиоза. У мутантов по гену sym33 из-за нарушения развития инфекциии выхода бактерий из инфекционных нитей, изменяются процессыдифференцировки тканей клубеньков. Следовательно, возможной функциейцитокининов на более поздних стадиях развития симбиоза может быть их участие вконтроле процессов дифференцировки.
Действительно, недавно выполненныеисследования показали участие цитокининов в контроле эндоредупликации идифференцировки тканей корня у модельных растений (Takanashi et al., 2013).Вместе с тем известно, что у мутантов по гену sym33 в ответ на инокуляциюактивируются ряд защитных белков и ферментов (Ivanova et al., 2015). Недавнобыло показано, что у мутанта бобового растения M. truncatula cre1 по рецептору уцитокининам значительно усиливаются защитные системы, что делает его болееустойчивым к заражению фитопатогенами (Laffont et al., 2015). В связи с этим,цитокинины в формирующихся клубеньках могут быть необходимы для подавлениязащитных систем растения, что способствует проникновению ризобий внутрьклеток растения и развитию внутриклеточной инфекции.Часть 4.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
