Автореферат (1144751), страница 7
Текст из файла (страница 7)
Изучение роли гомеодомен-содержащих транскрипционных факторовсемейств KNOX и WOX в контроле органогенеза клубеньков у гороха.В регуляции пролиферации и дифференцировки клеток важную роль играют нестолько сами гормоны, сколько их соотношение (баланс), который очень тонкорегулируется.
Известно, что существенную роль в такой регуляции играюттранскрипционные факторы двух семейств KNOX и WOX, которые влияют наэкспрессию генов, контролирующих биосинтез и катаболизм гормонов, а такжепервичный ответ растений на действие гормонов. Исследования на модельномрастении Arabidopsis показали, что мишенями транскрипционных факторов KNOX(KNAT1, STM) в меристеме побега являются гены, кодирующие ферментыбиосинтеза цитокининов изопентинилтрансферазы (IPT). В трансгенных растениях35S:STM активация STM (ТФ KNOX семейства) приводила к быстрому увеличениюсодержания мРНК AtIPT7 (Yanai et. al., 2005).
В экспериментах с использованиеманалогичных систем для представителя семейства KNOX - KNOTTED1 кукурузы,уровень мРНК AtIPT7 увеличивался до 30 раз по сравнению с контрольнымуровнем (Yanai et. al., 2005). Эти результаты позволяют предположить, что генбиосинтеза цитокинина IPT является мишенью ТФ KNOX. Для представителясемейства WOX - ТФ WUSСHEL, было показано участие в подавлении экспрессиигена цитокининового ответа RR А-типа, что стимулировало ответ растений нацитокинины и усиливало пролиферацию клеток в апикальной меристеме побега уArabidopsis.4.1 Изучение роли генов KNOX при развитии клубеньков у гороха P. sativum L.4.1.1 Идентификация генов семейства KNOX, играющих существенную роль в25контроле формирования клубеньков у гороха.У гороха были клонированы два гена семейства KNOX, KNOX1 (AF080104) иKNOX2 (AF080105) (Hofer et al., 2001). Для выявления новых представителей этогосемейства нами был проведен анализ четырех баз данных транскриптомов гороха:(Franssen et al., 2011; Kaur et al., 2012; Duarte et al., 2014; Zhukov et al., 2015).
Врезультате были выявлены полноразмерные и частичные транскрипты,соответствующие 9 предполагаемым генам KNOX гороха. Два из них, PsKNOX1 иPsKNOX2соответствовалипредварительноохарактеризованнымгенам.Последующий RACE анализ позволил выявить полноразмерные мРНК, которыебыли аннотированы как PsKNOX3 – PsKNOX6, 8,9 и 10.Анализ экспрессии генов KNOX показал, что наиболее существенно впроцессе развития симбиоза увеличивается экспрессия гена PsKNOX3 (рисунок 19)(Azarakhsh et al., 2015). Эти данные соответствуют результатам, полученным и прианализе экспрессии генов семейства KNOX у другого бобового растения M.truncatula (Azarakhsh et al., 2015).Рисунок 19. Анализ экспрессии генов PsKNOX в корнях гороха линии Frisson вответ на инокуляцию Rlv CIAM1026.
К-5 - контроль, дпи - дни после инокуляции.4.1.2. Анализ растений с эктопической и подавленной в результате РНКинтерференции экспрессией гена PsKNOX3.Для изучения возможного влияния KNOX3 на экспрессию генов биосинтезацитокининов, растения гороха дикого типа Frisson трансформироваликонструкциями PsKNOX3-OE (ген клонирован под промотором 35S) или GUS-OE(контроль).
Было показано, что на корнях трансгенных растений PsKNOX3-OE безинокуляции образуются клубенько-подобные структуры (спонтанные клубеньки),что свидетельствовало об активации делений кортикальных клеток под влияниемгена PsKNOX3 (рисунок 20) (Azarakhsh et al., 2015).Рисунок 20. Формирование спонтанных клубеньков на корнях трансгенныхрастений гороха со сверхэкспрессией гена PsKNOX3.26Аналогичный эффект наблюдали также при сверхэкспрессии гена MtKNOX3 у M.truncatula (Azarakhsh et al., 2015). В отличие от клубеньков, полученных наконтрольных растениях GUS-OE при инокуляции ризобиями, у этих клубеньков небыла развита периферическая проводящая система, и вместо нее был сформированцентральный проводящий пучок, что делало такие клубеньки похожими на боковыекорни (Azarakhsh et al., 2015).
Однако в спонтанных клубеньках значительноувеличивалась экспрессия гена NIN, который специфически индуцируется присимбиозе, но не в боковых корнях. Это позволило нам сделать вывод о позитивномвлиянии транскрипционного фактора KNOX3 на процесс формирования клубенькову гороха, поскольку он способен стимулировать деление клеток корня приорганогенезе (Azarakhsh et al., 2015).Для выявления возможных мишеней действия регулятора KNOX3 у гороха,мы проанализировали изменения в уровне экспрессии генов IPT и LOG вспонтанных клубеньках, полученных на трансгенных корнях растений,трансформированных конструкцией PsKNOX3-OE.
Было показано, что вспонтанных клубеньках был повышен уровень экспрессии гена LOG2,контролирующего биосинтез цитокинина, а также регулятора цитокининовогоответа RR8 А-типа (рисунок 21) по сравнению с клубеньками, образованными натрансгенных корнях GUS-OE при инокуляции ризобиями.Рисунок 21. Анализ экспрессии генов IPT и LOG в корнях трансгенныхрастений гороха со сверхэкспрессией гена PsKNOX3 (KNOX3-OE).Нами были также получены растения с подавлением экспрессии генаPsKNOX3 в результате РНК-интерференции (PsKNOX3-RNAi).
На корняхтрансгенных растений были сформированы клубеньки, количество которых неотличалось от количества клубеньков, образованных на контрольных растенияхGUS-OE (рисунок 22). Однако в этих клубеньках подавленной оказалась экспрессиягенов IPT3, LOG1 и LOG2, а также RR8 по сравнению с клубенькам трансгенныхрастений, содержащих конструкцию GUS-OE (Azarakhsh et al., 2015).
Схожимобразом, в клубеньках с подавлением экспрессии гена MtKNOX3 у M. truncatulaнаблюдали подавление экспрессии генов MtLOG1, MtIPT3, а также гена первичногоответа на цитокинин MtRR4 (Azarakhsh et al., 2015). Таким образом, мишенямидействия ТФ KNOX3 у растений гороха могут быть гены, контролирующиебиосинтез цитокининов, аналогично тому, как это осуществляется в других типахмеристем у растений.27Рисунок 22. Анализ экспрессии генов IPT и LOG в корнях трансгенныхрастений гороха с подавленной экспрессией PsKNOX3 в результате РНКинтерференции (KNOX3-RNAi).4.2 Идентификация генов WOX, контролирующих развития симбиоза.(Результаты исследований, представленные в разделах 4.2 и 4.3, были получены совместнос аспиранткой Cанкт-Петербургского государственного университета Лебедевой МариейАлександровной, соруководство кандидатской диссертацией которой осуществленоавтором настоящего диссертационного исследования).В апикальных меристемах растений транскрипционные факторы семейства WOXучаствуют в регуляции пролиферации клеток (они стимулируют пролиферациюклеток и подавляют их дифференцировку).
Проведенный ранее транскриптомныйанализ инокулированных корней модельного растения M. truncatula выявилзначительное увеличение экспрессии одного из представителей семействагомеобокс-содержащих транскрипционных факторов WOX - гена WOX5 (Benedito etal., 2008). В связи с этим, мы планировали идентифицировать гомолог гена WOX5 угороха, а также изучить влияние этого транскрипционного фактора на процессорганогенеза клубеньков у гороха. С помощью вырожденных праймеров кконсервативным участкам, подобранных на основании сравнительного анализануклеотидных последовательностей гена WOX5 M.
truncatula и WOX5 A. thaliana ипоследующей амплификации 5’ и 3’-концов кДНК (с помощью процедуры RACE),были определены последовательности полноразмерного гена WOX5, а также мРНКWOX5 у гороха.Анализ уровня экспрессии гена PsWOX5 показал его увеличение винокулированных корнях гороха дикого типа, начиная с 5-7 дпи.
Максимальноеувеличение экспрессии гена наблюдали на 11-12 дпи, а затем происходило егоснижение к 15 и 22 дпи (рисунок 23) (Osipova et al., 2011, 2012). На ранних срокахпосле инокуляции (5 - 7 дпи) в корнях растений гороха активно протекаютпроцессы деления клеток внутренних слоев коры и перицикла, приводящие кформированию примордия клубенька (Voroshilova et al., 2009). На этом срокепроисходит значительное увеличение экспрессии гена WOX5 в инокулированныхкорнях гороха. Следовательно, увеличение может быть связано с активнойпролиферацией клеток примордия клубенька, так как ген WOX5 может бытьвовлечен в регуляцию пролиферации клеток. Приблизительно на 9-11 дпипроисходит значительное увеличение размеров примордиев клубеньков, а такженаблюдается инфицирование делящихся клеток примордиев бактериями.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
