Автореферат (1144751), страница 8
Текст из файла (страница 8)
На этомэтапе уровень экспрессии гена WOX5 достигает максимального значения. На болеепоздних сроках происходит формирование меристемы клубенька и выход28клубенька на поверхность корня. Согласно нашим данным, к 15 дпи происходитзначительное снижение уровня экспрессии гена WOX5.Рисунок 23. Количественный анализ динамики экспрессии гена PsWOX5 приразвитии клубеньков у гороха линии Frisson методом ОТ-ПЦР (Osipova et al.,2011, 2012).Таким образом, начальное увеличение уровня экспрессии WOX5 по временисовпадает с активной пролиферацией клеток на ранних этапах развития клубенька(формированием примордия), а достижение максимума экспрессии гена WOX5 (911 дпи) предшествует формированию у клубенька собственной меристемы.
Приэтом дифференцировка тканей клубенька (примерно 15 дпи) сопровождаетсязначительным снижением уровня экспрессии этого гена. Выявленный характердинамики экспрессии гена указывает на его участие в контроле процессаформирования примордия/меристемы клубенька (Osipova et al., 2011, 2012).4.3. Локальный анализ активности гена WOX5 при органогенезе клубеньковгороха.Для локального анализа экспрессии гена WOX5 при развитии клубеньков горохабыла получена конструкция, содержащая промотор гомологичного гена M.truncatula, слитый с репортерным геном β-глюкуронидазы (GUS) (pМtWOX5::GUS).После введения этой конструкции в растения гороха Frisson, в неинокулированныхтрансгенных корнях гороха GUS-окрашивание наблюдали в кончиках корней внебольшой группе клеток (по-видимому, соответствующей покоящемуся центруапикальной меристемы корня).
По литературным данным сходным образомэкспрессия гена WOX5 была локализована в покоящемся центре меристемы корняарабидопсиса (Haecker et al., 2004). Это свидетельствовало о том, что полученнаяконструкция была эффективной для изучения локализации экспрессии гена WOX5 угороха.В инокулированных корнях растений гороха, трансформированныхконструкцией pMtWOX5::GUS, была локализована экспрессия гена WOX5 наразличных этапах развития клубенька (рисунок 24). У гороха на 5 - 7 день послеинокуляции GUS-окрашивание наблюдали в группе делящихся клеток перицикла,эндодермы и коры, что соответствует месту закладки примордия клубенька(рисунок 24). На последующих этапах клубенькообразования экспрессию генаWOX5 наблюдали в делящихся клетках развивающегося примордия клубенька.
Наболее поздних этапах развития клубенька (21 дпи) экспрессия гена WOX5сохраняется лишь в области окончаний проводящих пучков (рисунок 24). Такимобразом, локальный анализ экспрессии гена WOX5 с помощью генетическойконструкции pMtWOX5::GUS, подтвердил участие гена WOX5 в развитииклубенька. Данные по локализации экспрессии гена WOX5 на различных этапахразвития клубенька согласуются с данными по динамике экспрессии WOX5,полученными с помощью метода количественной ОТ-ПЦР.
Корреляция этих29данных подтверждает наше предположение о важной роли транскрипционногофактора WOX5 именно на ранних этапах развития клубенька – в процессеформирования примордия/меристемы клубенька (Osipova et al., 2012). Наблюдаемоеснижение экспрессии гена WOX5 на поздних этапах развития клубенька,выявленное с помощью количественной ОТ-ПЦР, соответствует ограничению зоныэкспрессии гена WOX5 в развивающемся клубеньке областями окончанийпроводящих пучков.Рисунок 24. Локальный анализ экспрессии WOX5 (pMtWOX5::GUS) вразвивающихся клубеньках гороха (A-Г).
Схема, иллюстрирующая локализациюэкспрессии гена WOX5 на различных этапах развития клубеньков (Osipova et al.,2012).Часть 5. Изучение сигнального обмена при системном регулированиибобовыми растениями числа формирующихся клубеньков (авторегуляциясимбиоза). (Результаты исследований, представленные в данном разделе, были полученысовместно с аспиранткой Cанкт-Петербургского государственного университетаЛебедевой Марией Александровной, соруководство кандидатской диссертацией которойосуществлено автором настоящего диссертационного исследования).Анализ литературных данных позволил предположить, что сигнальнымимолекулами, вырабатываемыми в корне и запускающими систему авторегуляции,могут являться CLE-пептиды.
У модельных бобовых растений (M. truncatula, L.japonicus) были выявлены гены, кодирующие CLE-пептиды (MtCLE13, LjCLE-RS1,LjCLERS2),экспрессиякоторыхспецифичноактивируетсяприклубенькообразовании (Okamoto et al. 2009, Mortier et al. 2010). Для наспредставляло интерес выяснить роль CLE-регуляторных пептидов в контролеорганогенеза клубеньков у гороха, а также механизмы взаимодействия этихпептидов с другими регуляторными компонентами растения, контролирующимиформирование клубеньков. Было высказано предположение, что CLE-пептиды,которые вырабатываются при клубенькообразовании в тканях корня,транспортируются в надземную часть растений, где запускают авторегуляцию,связываясь с их предположительным рецептором – CLV-подобными киназами(Okamoto et al. 2009, 2013; Mortier et al.
2010). Действительно, мутации в генах,кодирующих CLV1-подобный и CLV2 рецептор, а также KLV, приводят ксуперклубенькообразующему фенотипу (Krusell et al., 2002, 2011; Schnabel et al.,2005).Приэтомэкспериментыспрививкамипоказали,чтосуперклубенькообразующий фенотип таких мутантов определяется побеговойчастью растения, поэтому CLV1-подобный и СLV2, а также KLV рецепторыфункционируют в побеге (Miyazawa et al., 2010; Okamoto et al., 2013).5.1 Изучение роли CLE-регуляторных пептидов в контроле органогенеза30клубеньков у гороха.5.1.1 Идентификация CLE-пептидов у гороха, вовлеченных в системуавторегуляции симбиоза.По литературным данным в контроле авторегуляции симбиоза у модельныхбобовых растений основную роль играет MtCLE13-пептид у M.
truncatula и LjCLERS1, LjCLE-RS2-пептиды у L. japonicus (Okamoto et al., 2009; Magori andKawaguchi, 2010). Поиск гомологичного гена у гороха позволил выявить PsCLE13,кодирующий CLE-пептид гороха. Сравнительный анализ выявил высокий уровеньгомологии между последовательностями генов PsCLE13 гороха, MtCLE13 люцерныи LjCLE-RS1, LjCLE-RS2 лядвенца, прежде всего в области CLE-мотива (рисунок25).Рисунок 25. Анализ последовательностей специфичного для клубеньков CLEпептида гороха, MtCLE13 люцерны и LjCLE-RS1 и LjCLE-RS2 лядвенца.5.2 Анализ влияния сверхэкспрессии CLE-пептида на развитие клубеньков утрансгенных растений гороха.Для изучения влияния сверхэкспрессии CLE на процесс клубенькообразования угороха мы использовали конструкцию, содержащую ген CLE13 под контролемпромотора 35S (CLE-OE).
Нами были трансформированы растения гороха дикоготипа Frisson и суперклубенькообразующие мутанты гороха sym28 и sym29. Вкачестве контроля использовали конструкцию, содержащую ген β-глюкуронидазыпод контролем промотора 35S (GUS-OE).5.3 Анализ влияния сверхэкспрессии CLE-пептида на клубенькообразованиегороха дикого типа и суперклубенькообразующих мутантов с нарушениемпобеговой системы авторегуляции P88 (sym 29) и P64 (sym 28).Для оценки влияния сверхэкспрессии CLE-пептида на клубенькообразованиепроростки гороха линии Frisson были трансформированы штаммами A.
rhizogenes,содержащими конструкции для сверхэкспрессии либо 35S::MtCLE13 (CLE-OE),либо 35S::GUS (GUS-OE, контроль). Подсчет количества клубеньков проводили на21 дпи, при этом учитывали только клубеньки, образованные на трансгенныхкорнях гороха. У растений гороха Frisson эктопическая экспрессия MtCLE13приводила к значительному подавлению клубенькообразования (рисунок 26).Рисунок 26.
Влияние сверхэкспрессии гена MtCLE13 на количествообразующихся клубеньков у гороха дикого типа Frisson, трансформированныхGUS-OE (А, контроль) и CLE-OE (В) (Osipova et al., 2012).В то время как в контрольном варианте (GUS-OE) на корнях растений образовалисьв среднем 35 клубеньков нормальной морфологии на растение, только у нескольких31растений Frisson, трансформированных CLE-OE, наблюдалось формированиеединичных клубеньков на трансгенных корнях (в среднем 2 клубенька на растение).Таким образом, у растений дикого типа линии Frisson сверхэкспрессия MtCLE13приводила к резкому снижению количества клубеньков и замедлению развитияредких образующихся клубеньков. Как известно по литературным данным,аналогичный эффект на процесс клубенькообразования оказывала сверхэкспрессияCLE-пептида у люцерны (MtCLE13) и лядвенца (LjCLE-RS1, LjCLE-RS2) (Okamotoet al. 2009, Mortier et al.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
