Автореферат (1144751), страница 5
Текст из файла (страница 5)
Анализ влияния Lyk9 на развитие устойчивости гороха к фитопатогеннымгрибам.Для анализа влияния рецептора Lyk9 на иммунитет растений гороха нами былиполучены растения с подавленной экспрессией гена PsLyk9 с помощью РНКинтерференции. При заражении слабопатогенным штаммом грибов F. culmorum 891у растений с подавленной экспрессией гена (PsLyk9-RNAi) признаки заболеваниябыли выражены сильнее по сравнению с контрольными растениями(трансформированными конструкцией для синтеза белка β-глюкуронидазы (GUS).Кроме того, у таких растений уровни экспрессии генов-маркеров защитного ответа,PsPAL2 и PsPR1, PsPR10 были снижены по сравнению с контролем. Обработкатрансгенных растений гороха с подавленной экспрессией гена PsLyk9 ХОС состепенью полимеризации (n = 8) (эти соединения являются эффективнымиэлиситорами защитных реакций у гороха), показала снижение у них уровняэкспрессии генов PsPAL2, PsPR1 и PsPR10 (рисунок 8).16Таким образом, полученные данные свидетельствуют о том, что рецепторнаякиназа Lyk9 участвует в реакции растений гороха на обработку ХОС не только снизкой, но и высокой степенью полимеризации (n = 8), а также в активациизащитных реакций.
Это доказывает функциональное сходство рецепторной киназыLyk9 гороха с рецептором риса CERK1.Рисунок 8. Анализ экспрессии генов PsPAL1, PsPAL2, PsPR1, PsPR10,кодирующих защитные ферменты и белки, у трансгенных растений гороха сподавленной экспрессией гена PsLyk9 в ответ на обработку ХОС (n = 8).2.4. Получение хитоолигосахаридов с разной степенью полимеризации спомощью биологического синтеза.(Результаты исследований, представленные в разделе 2.4, были получены совместно ссотрудником ФГБНУ ВНИИСХМ Леппянен Ириной Викторовной, руководствокандидатской диссертацией которой осуществлено автором настоящего диссертационногоисследования).В рамках нашей работы была также решена задача биосинтетическогополучения олигомеров хитина с разной степенью полимеризации, что являетсяосновой для практического использования этих сигнальных молекул.
Интерес киспользованию олигомеров хитина связан со способностью этих соединений влиятьна развитие симбиоза (n = 4 -5) и повышать устойчивость растений к заражениюфитопатогенами (n ≥ 6). В связи с этим, олигомеры хитина с определеннойстепенью полимеризации могут применяться для обработки растений. Для синтезаХОС (n = 5 и 6) гены nodC двух штаммов ризобий M. loti CIAM1803 и Rhizobium sp.GRH2, кодирующиеферментN-ацетил-глюкозаминилтрансферазу, быликлонированы по сайтам BamH1 и EcoR1 в плазмиде pUC19 под промотором lacZ(Leppyanen et al., 2014). При гетерологичной экспрессии в штамме E.
coli DH5αгенов nodC M. loti и Rhizobium sp. GRH2, контролирующих синтез этих соединений,удалось синтезировать олигомеры хитина с необходимой степенью полимеризации.При культивировании бактерий E. сoli DH5α, содержащих плазмиду pUC19MlnodC, была получена пента-N-ацетилхитопентаоза. Кроме того, прикультивировании штамма E. сoli DH5α, содержащего плазмиду pUC19-GRH2nodC,в присутствии предшественника N-ацетилглюкозамина были синтезированы пентаN-ацетилхитопентаоза и гекса-N-ацетилхитогексаоза (Leppyanen et al., 2014).Очистку полученных соединений проводили методом высокоэффективнойжидкостной хроматографии.
С помощью метода масс-спектрометрии осуществлялианализ синтезированных веществ, который подтвердил, что эти вещества являютсяпента-N-ацетилхитопентаозой и гекса-N-ацетилхитогексаозой. Таким образом, впроцессе контролируемого синтеза были получены вещества со степенямиполимеризации пять и шесть остатков N-ацетилглюкозамина. Разработанный новыйспособ получения олигомеров хитина может стать основой для практическогоиспользования этих сигнальных молекул.17Часть 3.
Анализ взаимодействия компонентов сигнального каскада,активируемого Nod-факторами, с фитогормонами цитокининами и ауксинами.Цитокинины и ауксины являются важными регуляторами роста и развития высшихрастений. Они также вовлечены в контроль развития симбиотических клубеньков(Gonzalez-Rizzo et al., 2006; Tirichine et al., 2007), при этом их роль остаетсямалоизученной. Для выяснения роли цитокининов и ауксинов при симбиозенеобходимо было узнать, как взаимодействуют между собой компонентысигнального пути, активируемые Nod-факторами и фитогормоны, а также какимобразом осуществляется передача сигнала от Nod-фактора в клетки корня сучастием этих регуляторов. Кроме того, практически неизученным оставалсявопрос о том, связано ли влияние цитокининов и ауксинов наклубенькообразование с изменениями в биосинтезе, активации или процессахтранспорта этих гормонов.3.1.
Локализация ответа растений гороха на цитокинины и ауксины спомощью ауксин- и цитокинин-регулируемых репортерных конструкцийDR5::GFP и pRR4::GUS.Для изучения влияния фитогормонов цитокининов и ауксинов на развитиеклубеньков у гороха нами проводился анализ трансгенных растений, содержащихгенетические конструкции с промоторами ауксин- и цитокинин-регулируемыхгенов (DR5::GFP-NLS, pRR4::GUS). У трансгенных растений гороха линии SGE,содержащих конструкцию DR5::GFP-NLS (NLS – сигнал ядерной локализации),ответ на ауксины наблюдался на ранних этапах развития клубеньков в делящихсяклетках перицикла, эндодермы и внутренней коры корня (рисунки 9а). Такаялокализация свидетельствует о необходимости ауксинов для контроля начальныхэтапов развития клубеньков.
В сформированном клубеньке ответ на ауксины былограничен только периферической зоной клубенька – меристемой, корой клубенькаи проводящими пучками (рисунки 9б).Рисунок 9. Локализация ответа на ауксины в развивающихся примордиях (а)и меристеме клубеньков гороха (б) дикого типа SGE, содержащих ауксинрегулируемую конструкцию DR5::GFP-NLS.Анализ трансгенных растений, содержащих конструкцию pRR4::GUS спромотором цитокинин-регулируемого гена, выявил ответ на цитокинины вформирующихся примордиях клубеньков (в перицикле, эндодерме и коре) (рисунок10). В сформированном клубеньке GUS-окрашивание было выявлено в меристеме(I) и зоне заражения (II), а также начале зоны азотфиксации (Ш) (рисунок 10), чтопредполагает участие цитокининов в регуляции развития меристемы клубеньков, атакже контроле более поздних этапов, связанных с инфекционным процессом идифференцировкой тканей клубенька.
Таким образом, у гороха цитокинины могутбыть вовлечены в контроль не только ранних, но и более поздних этапов развитиясимбиоза.18Рисунок 10. Локализация ответа на цитокинины в развивающихсяпримордиях и клубеньках растений гороха дикого типа SGE (14 дпи) спомощью цитокинин-регулируемой конструкции pRR4::GUS. Обозначения: I –меристема, II – зона заражения, интерзона II-III, III – зона азотфиксации, IV – зонастарения, vb – проводящие пучки.3.2.
Поиск у гороха генов первичного ответа на цитокинины (RR А- и B-типа),а также генов, контролирующих биосинтез цитокининов и их переход вактивное состояние (IPT и LOG), экспрессия которых возрастает при развитиисимбиоза.Для ответа на вопрос о том, что лежит в основе изменений в содержании гормонов,был проведен поиск и анализ экспрессии генов у гороха, контролирующихметаболизм цитокининов и ауксинов, а также ответ растений на действие этихгормонов. В результате выполненных исследований удалось выявить у гороха 6геновIPT(кодируютосновнойферментбиосинтезацитокининовизопентениладенин трансферазу), 6 генов LOG (кодируют рибозо-5-монофосфатфосфорибогидролазу) и 6 генов RR, кодирующих регуляторы цитокининовогоответа RR А-типа (по увеличению экспрессии этих генов можно судить обактивации рецептора к цитокининам).Анализ динамики экспрессии генов RR А-типа показал, что экспрессия трехрегуляторов цитокининового ответа PsRR5, PsRR9 и PsRR11 увеличивалась угороха при инициации симбиоза на 1 - 3 дпи (рисунок 11).
Повторное увеличениеэкспрессии генов регуляторов цитокининового ответа происходило в процессеразвития клубеньков, начиная с 5 – 7 дпи и достигая максимума на 11 – 14 дпи. Приэтом наиболее существенно в процессе развития клубеньков изменялась экспрессиягенов PsRR4 (в 2-3 раза), PsRR8 (в 3 -5 раз) и PsRR11 (в 80 – 90 раз) (рисунок 11).Следовательно, активация рецептора к цитокининам у гороха происходит нанескольких этапах развития симбиоза.У гороха два гена PsIPT1 и PsIPT2, кодирующих изопентениладенинтрансферазу, индуцируются в корнях еще до закладки клубеньков в ответ наинокуляцию (1 – 3 дпи) (рисунок 12).
Индукция экспрессии этих генов может бытьсвязана с наиболее ранними стадиями развития симбиоза. В процессе развитияклубеньков увеличивалась экспрессия генов PsIPT1, PsIPT3 и PsIPT4, начиная с 5 7 дпи и достигая максимума на 11-14 дпи (рисунок 12). В дополнение к этомууровни экспрессии генов PsLOG1, 2, 4 и 5 также увеличивались на 7 дпи, амаксимума уровень экспрессии этих генов достигал в уже сформированныхклубеньках на 11 - 14 дпи (в 25 – 30 раз для PsLOG1 и в 3 – 5 раз для PsLOG2, в 5 –10 раз для PsLOG4 и PsLOG5) (рисунок 13).На основании проведенного анализа основных генов, контролирующихметаболизм цитокининов и вовлеченных в первичный ответ растений на действиеэтих гормонов, можно сделать вывод о том, что цитокинины оказывают19Рисунок 11. Анализ экспрессии генов цитокининового ответа PsRR4, PsRR5,PsRR8, PsRR9 и PsRR11 А-типа в корнях гороха линии Frisson на различныхсроках после инокуляции методом ОТ-ПЦР в реальном времени.
К – контрольбез инокуляции, дпи – дни после инокуляции).Рисунок 12. Экспрессия генов IPT1-6 в корнях гороха Frisson в ответ наинокуляцию Rh. leguminosarum bv. viciae CIAM1026.Рисунок 13. Анализ экспрессии генов PsLOG1, PsLOG2, PsLOG4 -6 в корняхгороха линии Frisson при инокуляции Rh. leguminosarum bv. viciae CIAM1026на разных сроках после инокуляции.20существенное влияние, как на сам процесс инициации симбиоза, так и на закладку иразвитие клубеньков у гороха. Наиболее ранний ответ растений на цитокининынаблюдается на 1 – 3 дпи, а затем на 7 – 11 дпи (период, когда происходитформирование примордиев и развитие клубеньков у гороха).
Цитокинины играютважную роль и в функционирующих клубеньках, поскольку в них достигает оченьвысокого уровня экспрессия гена PsRR11. При этом изменения в содержаниицитокининов могут быть связаны с биосинтезом этих гормонов.3.3. Анализ содержания различных форм цитокининов в корнях гороха приинокуляции Rlv CIAM1026.Нас интересовало, приводит ли повышение экспрессии генов IPT и LOG кувеличению содержания различных форм цитокининов в корнях гороха.
С этойцелью был проведен анализ содержания различных форм цитокининов в корняхгороха. Наиболее значительно в корнях гороха увеличивалось содержание трансзеатина и изопентениладенина в ответ на инокуляцию на 3 дпи, затем к 7 - 10 дписодержание фитогормона транс-зеатина возрастало вновь (рисунок 14).Рисунок 14.
Содержание различных форм цитокининов - транс-зеатина (TZ),изопентениладенина (IPA) и бензиладенина (BA) - в неинокулированныхкорнях гороха линии Frisson, а также после инокуляции на 3, 7 и 10 дпи.3.4. Идентификация и анализ экспрессии генов гороха, контролирующихбиосинтез и транспорт ауксинов.Для изучения причин возможных изменений в содержании ауксинов приформировании клубеньков у гороха, был проведен анализ генов, кодирующихферменты биосинтеза ауксинов TAR, YUCCA, а также переносчики ауксинов PIN.Нами были идентифицированы 3 гена TAR, 4 гена YUCCA и 11 генов PIN у гороха.Анализ не выявил существенных изменений в экспрессии генов TAR и YUCCA урастений линии SGE.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
