Главная » Просмотр файлов » Автореферат

Автореферат (1144751), страница 5

Файл №1144751 Автореферат (Сигнальная регуляция развития симбиоза гороха Pisum sativum L. с клубеньковыми бактериями) 5 страницаАвтореферат (1144751) страница 52019-06-29СтудИзба
Просмтор этого файла доступен только зарегистрированным пользователям. Но у нас супер быстрая регистрация: достаточно только электронной почты!

Текст из файла (страница 5)

Анализ влияния Lyk9 на развитие устойчивости гороха к фитопатогеннымгрибам.Для анализа влияния рецептора Lyk9 на иммунитет растений гороха нами былиполучены растения с подавленной экспрессией гена PsLyk9 с помощью РНКинтерференции. При заражении слабопатогенным штаммом грибов F. culmorum 891у растений с подавленной экспрессией гена (PsLyk9-RNAi) признаки заболеваниябыли выражены сильнее по сравнению с контрольными растениями(трансформированными конструкцией для синтеза белка β-глюкуронидазы (GUS).Кроме того, у таких растений уровни экспрессии генов-маркеров защитного ответа,PsPAL2 и PsPR1, PsPR10 были снижены по сравнению с контролем. Обработкатрансгенных растений гороха с подавленной экспрессией гена PsLyk9 ХОС состепенью полимеризации (n = 8) (эти соединения являются эффективнымиэлиситорами защитных реакций у гороха), показала снижение у них уровняэкспрессии генов PsPAL2, PsPR1 и PsPR10 (рисунок 8).16Таким образом, полученные данные свидетельствуют о том, что рецепторнаякиназа Lyk9 участвует в реакции растений гороха на обработку ХОС не только снизкой, но и высокой степенью полимеризации (n = 8), а также в активациизащитных реакций.

Это доказывает функциональное сходство рецепторной киназыLyk9 гороха с рецептором риса CERK1.Рисунок 8. Анализ экспрессии генов PsPAL1, PsPAL2, PsPR1, PsPR10,кодирующих защитные ферменты и белки, у трансгенных растений гороха сподавленной экспрессией гена PsLyk9 в ответ на обработку ХОС (n = 8).2.4. Получение хитоолигосахаридов с разной степенью полимеризации спомощью биологического синтеза.(Результаты исследований, представленные в разделе 2.4, были получены совместно ссотрудником ФГБНУ ВНИИСХМ Леппянен Ириной Викторовной, руководствокандидатской диссертацией которой осуществлено автором настоящего диссертационногоисследования).В рамках нашей работы была также решена задача биосинтетическогополучения олигомеров хитина с разной степенью полимеризации, что являетсяосновой для практического использования этих сигнальных молекул.

Интерес киспользованию олигомеров хитина связан со способностью этих соединений влиятьна развитие симбиоза (n = 4 -5) и повышать устойчивость растений к заражениюфитопатогенами (n ≥ 6). В связи с этим, олигомеры хитина с определеннойстепенью полимеризации могут применяться для обработки растений. Для синтезаХОС (n = 5 и 6) гены nodC двух штаммов ризобий M. loti CIAM1803 и Rhizobium sp.GRH2, кодирующиеферментN-ацетил-глюкозаминилтрансферазу, быликлонированы по сайтам BamH1 и EcoR1 в плазмиде pUC19 под промотором lacZ(Leppyanen et al., 2014). При гетерологичной экспрессии в штамме E.

coli DH5αгенов nodC M. loti и Rhizobium sp. GRH2, контролирующих синтез этих соединений,удалось синтезировать олигомеры хитина с необходимой степенью полимеризации.При культивировании бактерий E. сoli DH5α, содержащих плазмиду pUC19MlnodC, была получена пента-N-ацетилхитопентаоза. Кроме того, прикультивировании штамма E. сoli DH5α, содержащего плазмиду pUC19-GRH2nodC,в присутствии предшественника N-ацетилглюкозамина были синтезированы пентаN-ацетилхитопентаоза и гекса-N-ацетилхитогексаоза (Leppyanen et al., 2014).Очистку полученных соединений проводили методом высокоэффективнойжидкостной хроматографии.

С помощью метода масс-спектрометрии осуществлялианализ синтезированных веществ, который подтвердил, что эти вещества являютсяпента-N-ацетилхитопентаозой и гекса-N-ацетилхитогексаозой. Таким образом, впроцессе контролируемого синтеза были получены вещества со степенямиполимеризации пять и шесть остатков N-ацетилглюкозамина. Разработанный новыйспособ получения олигомеров хитина может стать основой для практическогоиспользования этих сигнальных молекул.17Часть 3.

Анализ взаимодействия компонентов сигнального каскада,активируемого Nod-факторами, с фитогормонами цитокининами и ауксинами.Цитокинины и ауксины являются важными регуляторами роста и развития высшихрастений. Они также вовлечены в контроль развития симбиотических клубеньков(Gonzalez-Rizzo et al., 2006; Tirichine et al., 2007), при этом их роль остаетсямалоизученной. Для выяснения роли цитокининов и ауксинов при симбиозенеобходимо было узнать, как взаимодействуют между собой компонентысигнального пути, активируемые Nod-факторами и фитогормоны, а также какимобразом осуществляется передача сигнала от Nod-фактора в клетки корня сучастием этих регуляторов. Кроме того, практически неизученным оставалсявопрос о том, связано ли влияние цитокининов и ауксинов наклубенькообразование с изменениями в биосинтезе, активации или процессахтранспорта этих гормонов.3.1.

Локализация ответа растений гороха на цитокинины и ауксины спомощью ауксин- и цитокинин-регулируемых репортерных конструкцийDR5::GFP и pRR4::GUS.Для изучения влияния фитогормонов цитокининов и ауксинов на развитиеклубеньков у гороха нами проводился анализ трансгенных растений, содержащихгенетические конструкции с промоторами ауксин- и цитокинин-регулируемыхгенов (DR5::GFP-NLS, pRR4::GUS). У трансгенных растений гороха линии SGE,содержащих конструкцию DR5::GFP-NLS (NLS – сигнал ядерной локализации),ответ на ауксины наблюдался на ранних этапах развития клубеньков в делящихсяклетках перицикла, эндодермы и внутренней коры корня (рисунки 9а). Такаялокализация свидетельствует о необходимости ауксинов для контроля начальныхэтапов развития клубеньков.

В сформированном клубеньке ответ на ауксины былограничен только периферической зоной клубенька – меристемой, корой клубенькаи проводящими пучками (рисунки 9б).Рисунок 9. Локализация ответа на ауксины в развивающихся примордиях (а)и меристеме клубеньков гороха (б) дикого типа SGE, содержащих ауксинрегулируемую конструкцию DR5::GFP-NLS.Анализ трансгенных растений, содержащих конструкцию pRR4::GUS спромотором цитокинин-регулируемого гена, выявил ответ на цитокинины вформирующихся примордиях клубеньков (в перицикле, эндодерме и коре) (рисунок10). В сформированном клубеньке GUS-окрашивание было выявлено в меристеме(I) и зоне заражения (II), а также начале зоны азотфиксации (Ш) (рисунок 10), чтопредполагает участие цитокининов в регуляции развития меристемы клубеньков, атакже контроле более поздних этапов, связанных с инфекционным процессом идифференцировкой тканей клубенька.

Таким образом, у гороха цитокинины могутбыть вовлечены в контроль не только ранних, но и более поздних этапов развитиясимбиоза.18Рисунок 10. Локализация ответа на цитокинины в развивающихсяпримордиях и клубеньках растений гороха дикого типа SGE (14 дпи) спомощью цитокинин-регулируемой конструкции pRR4::GUS. Обозначения: I –меристема, II – зона заражения, интерзона II-III, III – зона азотфиксации, IV – зонастарения, vb – проводящие пучки.3.2.

Поиск у гороха генов первичного ответа на цитокинины (RR А- и B-типа),а также генов, контролирующих биосинтез цитокининов и их переход вактивное состояние (IPT и LOG), экспрессия которых возрастает при развитиисимбиоза.Для ответа на вопрос о том, что лежит в основе изменений в содержании гормонов,был проведен поиск и анализ экспрессии генов у гороха, контролирующихметаболизм цитокининов и ауксинов, а также ответ растений на действие этихгормонов. В результате выполненных исследований удалось выявить у гороха 6геновIPT(кодируютосновнойферментбиосинтезацитокининовизопентениладенин трансферазу), 6 генов LOG (кодируют рибозо-5-монофосфатфосфорибогидролазу) и 6 генов RR, кодирующих регуляторы цитокининовогоответа RR А-типа (по увеличению экспрессии этих генов можно судить обактивации рецептора к цитокининам).Анализ динамики экспрессии генов RR А-типа показал, что экспрессия трехрегуляторов цитокининового ответа PsRR5, PsRR9 и PsRR11 увеличивалась угороха при инициации симбиоза на 1 - 3 дпи (рисунок 11).

Повторное увеличениеэкспрессии генов регуляторов цитокининового ответа происходило в процессеразвития клубеньков, начиная с 5 – 7 дпи и достигая максимума на 11 – 14 дпи. Приэтом наиболее существенно в процессе развития клубеньков изменялась экспрессиягенов PsRR4 (в 2-3 раза), PsRR8 (в 3 -5 раз) и PsRR11 (в 80 – 90 раз) (рисунок 11).Следовательно, активация рецептора к цитокининам у гороха происходит нанескольких этапах развития симбиоза.У гороха два гена PsIPT1 и PsIPT2, кодирующих изопентениладенинтрансферазу, индуцируются в корнях еще до закладки клубеньков в ответ наинокуляцию (1 – 3 дпи) (рисунок 12).

Индукция экспрессии этих генов может бытьсвязана с наиболее ранними стадиями развития симбиоза. В процессе развитияклубеньков увеличивалась экспрессия генов PsIPT1, PsIPT3 и PsIPT4, начиная с 5 7 дпи и достигая максимума на 11-14 дпи (рисунок 12). В дополнение к этомууровни экспрессии генов PsLOG1, 2, 4 и 5 также увеличивались на 7 дпи, амаксимума уровень экспрессии этих генов достигал в уже сформированныхклубеньках на 11 - 14 дпи (в 25 – 30 раз для PsLOG1 и в 3 – 5 раз для PsLOG2, в 5 –10 раз для PsLOG4 и PsLOG5) (рисунок 13).На основании проведенного анализа основных генов, контролирующихметаболизм цитокининов и вовлеченных в первичный ответ растений на действиеэтих гормонов, можно сделать вывод о том, что цитокинины оказывают19Рисунок 11. Анализ экспрессии генов цитокининового ответа PsRR4, PsRR5,PsRR8, PsRR9 и PsRR11 А-типа в корнях гороха линии Frisson на различныхсроках после инокуляции методом ОТ-ПЦР в реальном времени.

К – контрольбез инокуляции, дпи – дни после инокуляции).Рисунок 12. Экспрессия генов IPT1-6 в корнях гороха Frisson в ответ наинокуляцию Rh. leguminosarum bv. viciae CIAM1026.Рисунок 13. Анализ экспрессии генов PsLOG1, PsLOG2, PsLOG4 -6 в корняхгороха линии Frisson при инокуляции Rh. leguminosarum bv. viciae CIAM1026на разных сроках после инокуляции.20существенное влияние, как на сам процесс инициации симбиоза, так и на закладку иразвитие клубеньков у гороха. Наиболее ранний ответ растений на цитокининынаблюдается на 1 – 3 дпи, а затем на 7 – 11 дпи (период, когда происходитформирование примордиев и развитие клубеньков у гороха).

Цитокинины играютважную роль и в функционирующих клубеньках, поскольку в них достигает оченьвысокого уровня экспрессия гена PsRR11. При этом изменения в содержаниицитокининов могут быть связаны с биосинтезом этих гормонов.3.3. Анализ содержания различных форм цитокининов в корнях гороха приинокуляции Rlv CIAM1026.Нас интересовало, приводит ли повышение экспрессии генов IPT и LOG кувеличению содержания различных форм цитокининов в корнях гороха.

С этойцелью был проведен анализ содержания различных форм цитокининов в корняхгороха. Наиболее значительно в корнях гороха увеличивалось содержание трансзеатина и изопентениладенина в ответ на инокуляцию на 3 дпи, затем к 7 - 10 дписодержание фитогормона транс-зеатина возрастало вновь (рисунок 14).Рисунок 14.

Содержание различных форм цитокининов - транс-зеатина (TZ),изопентениладенина (IPA) и бензиладенина (BA) - в неинокулированныхкорнях гороха линии Frisson, а также после инокуляции на 3, 7 и 10 дпи.3.4. Идентификация и анализ экспрессии генов гороха, контролирующихбиосинтез и транспорт ауксинов.Для изучения причин возможных изменений в содержании ауксинов приформировании клубеньков у гороха, был проведен анализ генов, кодирующихферменты биосинтеза ауксинов TAR, YUCCA, а также переносчики ауксинов PIN.Нами были идентифицированы 3 гена TAR, 4 гена YUCCA и 11 генов PIN у гороха.Анализ не выявил существенных изменений в экспрессии генов TAR и YUCCA урастений линии SGE.

Характеристики

Тип файла
PDF-файл
Размер
1,46 Mb
Предмет
Высшее учебное заведение

Список файлов диссертации

Свежие статьи
Популярно сейчас
Почему делать на заказ в разы дороже, чем купить готовую учебную работу на СтудИзбе? Наши учебные работы продаются каждый год, тогда как большинство заказов выполняются с нуля. Найдите подходящий учебный материал на СтудИзбе!
Ответы на популярные вопросы
Да! Наши авторы собирают и выкладывают те работы, которые сдаются в Вашем учебном заведении ежегодно и уже проверены преподавателями.
Да! У нас любой человек может выложить любую учебную работу и зарабатывать на её продажах! Но каждый учебный материал публикуется только после тщательной проверки администрацией.
Вернём деньги! А если быть более точными, то автору даётся немного времени на исправление, а если не исправит или выйдет время, то вернём деньги в полном объёме!
Да! На равне с готовыми студенческими работами у нас продаются услуги. Цены на услуги видны сразу, то есть Вам нужно только указать параметры и сразу можно оплачивать.
Отзывы студентов
Ставлю 10/10
Все нравится, очень удобный сайт, помогает в учебе. Кроме этого, можно заработать самому, выставляя готовые учебные материалы на продажу здесь. Рейтинги и отзывы на преподавателей очень помогают сориентироваться в начале нового семестра. Спасибо за такую функцию. Ставлю максимальную оценку.
Лучшая платформа для успешной сдачи сессии
Познакомился со СтудИзбой благодаря своему другу, очень нравится интерфейс, количество доступных файлов, цена, в общем, все прекрасно. Даже сам продаю какие-то свои работы.
Студизба ван лав ❤
Очень офигенный сайт для студентов. Много полезных учебных материалов. Пользуюсь студизбой с октября 2021 года. Серьёзных нареканий нет. Хотелось бы, что бы ввели подписочную модель и сделали материалы дешевле 300 рублей в рамках подписки бесплатными.
Отличный сайт
Лично меня всё устраивает - и покупка, и продажа; и цены, и возможность предпросмотра куска файла, и обилие бесплатных файлов (в подборках по авторам, читай, ВУЗам и факультетам). Есть определённые баги, но всё решаемо, да и администраторы реагируют в течение суток.
Маленький отзыв о большом помощнике!
Студизба спасает в те моменты, когда сроки горят, а работ накопилось достаточно. Довольно удобный сайт с простой навигацией и огромным количеством материалов.
Студ. Изба как крупнейший сборник работ для студентов
Тут дофига бывает всего полезного. Печально, что бывают предметы по которым даже одного бесплатного решения нет, но это скорее вопрос к студентам. В остальном всё здорово.
Спасательный островок
Если уже не успеваешь разобраться или застрял на каком-то задание поможет тебе быстро и недорого решить твою проблему.
Всё и так отлично
Всё очень удобно. Особенно круто, что есть система бонусов и можно выводить остатки денег. Очень много качественных бесплатных файлов.
Отзыв о системе "Студизба"
Отличная платформа для распространения работ, востребованных студентами. Хорошо налаженная и качественная работа сайта, огромная база заданий и аудитория.
Отличный помощник
Отличный сайт с кучей полезных файлов, позволяющий найти много методичек / учебников / отзывов о вузах и преподователях.
Отлично помогает студентам в любой момент для решения трудных и незамедлительных задач
Хотелось бы больше конкретной информации о преподавателях. А так в принципе хороший сайт, всегда им пользуюсь и ни разу не было желания прекратить. Хороший сайт для помощи студентам, удобный и приятный интерфейс. Из недостатков можно выделить только отсутствия небольшого количества файлов.
Спасибо за шикарный сайт
Великолепный сайт на котором студент за не большие деньги может найти помощь с дз, проектами курсовыми, лабораторными, а также узнать отзывы на преподавателей и бесплатно скачать пособия.
Популярные преподаватели
Добавляйте материалы
и зарабатывайте!
Продажи идут автоматически
6361
Авторов
на СтудИзбе
310
Средний доход
с одного платного файла
Обучение Подробнее