Автореферат (1144751), страница 10
Текст из файла (страница 10)
891. Снижение устойчивостик заражению коррелировало с пониженным уровнем экспрессии генов,кодирующих защитные белки PR10, PR1, PAL2. Полученные результаты позволяютсделать вывод о том, что Lyk9 является бифункциональным рецептором, которыйконтролирует формирование АМ симбиоза и развитие устойчивости кфитопатогенам. Изучение принципов работы такого рецептора необходимо дляпонимания того, как у растений формируется симбиоз или, напротив, индуцируетсясистема устойчивости, препятствующая развитию внутриклеточной инфекции.Выполненные исследования показали, что у гороха при развитии симбиозапроисходят существенные изменения в содержании гормонов цитокининов иауксинов.
Эти изменения связаны как с начальными этапами формированияклубеньков, так и с последующими более поздними стадиями - развитиеминфекционного процесса и дифференцировкой тканей клубенька. Действительно,анализ динамики экспрессии генов, кодирующих регуляторы цитокининовогоответа RR А-типа, показал, что активация рецептора к цитокининам у гороха можетпроисходить на нескольких этапах при развитии симбиотических клубеньков.
Вответ на инокуляцию гороха ризобиями происходит активация рецептора кцитокининам еще до закладки примордиев клубеньков, а в формирующихсяклубеньках вновь возрастает уровень экспрессии генов маркеров цитокининовогоответа, что свидетельствует о дополнительной стимуляции рецептора. Эти35изменения коррелировали с увеличением содержания транс-зеатина иизопентениладенина на ранних сроках после инокуляции (1 – 3 дпи), а также вформирующихся клубеньках гороха (7 – 10 дпи).Активация ауксин-регулируемой репортерной конструкции DR5::GUS-NLS вразвивающихся примордиях клубеньков гороха свидетельствует и о локальномнакоплении ауксинов.
Было установлено, что у растений гороха в ответ наинокуляцию на ранних стадиях развития симбиоза (1 – 3 дпи) происходятизменения экспрессии генов, кодирующих переносчики ауксина PIN, что можетприводить к нарушению ПАТ и перенаправлению потока ауксина в клеткиформирующегося примордия. Следовательно, появлению клубеньков предшествуетсоздание «максимумов концентрации» ауксинов в клетках, из которых вдальнейшем развиваются примордии этих органов у бобовых растений.
Созданиетаких «максимумов» зависит от Nod-факторов и активации цитокининового ответав растениях и контролируется за счет транспорта ауксинов. Влияние цитокининовна белки-транспортеры ауксина PIN и транспорт ауксинов при формированииклубеньков имеет много общего с участием цитокининов в контроле программыразвития боковых корней, что может свидетельствовать об эволюционном родстведвух морфогенетических программ.Анализ мутантов с нарушением способности формировать клубеньки (Nod фенотип) показал, что стимуляция рецептора к цитокинам зависит от биосинтезаэтих гормонов в самом растении за счет ферментов IPT и LOG.
Было установлено,что отсутствие способности формировать клубеньки у Nod- мутантов горохакоррелирует с отсутствием активации ряда генов биосинтеза цитокининов IPT иLOG. Это подтверждает важность именно синтеза цитокининов в растениях дляактивации рецептора к этим гормонам и формирования клубеньков.Важным являлось выяснение роли цитокининов на более поздних этапахразвития клубеньков. Нам удалось показать, что увеличение содержанияцитокининов в уже сформированных клубеньках зависит от инфекционногопроцесса. У мутантов гороха с нарушением выхода бактерий из инфекционныхнитей в ткани клубенька, отсутствовала активация генов PsIPT3 и PsLOG1, 2, 4 и 5.Возможной функцией цитокининов на более поздних стадиях развития симбиозаможет быть их участие в контроле процессов эндоредупликации идифференцировки тканей клубенька. Другой возможной причиной накопленияцитокининов уже в формирующихся клубеньках может быть их участие вподавлении защитных систем растения, что способствует проникновению ризобийвнутрь клеток растения и развитию внутриклеточной инфекции.
В пользу этогопредположения свидетельствуют данные по изучению мутанта бобовых растенийпо рецептору у цитокининам cre1, который оказался более устойчивым кзаражению фитопатогенами (Laffont et al., 2015).Нами была изучена роль меристем-специфичных транскрипционныхфакторов KNOX3 и WOX5 в контроле клубенькообразования. Локальный анализэкспрессии этих генов в трансгенных растениях, содержащих репортерныеконструкции, показал непосредственное участие двух транскрипционныхрегуляторов в процессе развития симбиотических клубеньков у гороха. Ранее рольТФ KNOX и WOX семейств была изучена, главным образом, для апикальныхмеристем растений – ПАМ и КАМ.
Выполненные нами эксперименты позволилипоказать участие в регуляции развития примордия/меристемы клубенька ТФ KNOXи WOX семейств, что предполагает наличие сходных механизмов контроля36развития разных типов меристем у растений с участием универсальныхрегуляторов. На фоне эктопической экспрессии ТФ KNOX3 у растений горохамогут образовываться клубенько-подобные структуры, которые большенапоминают видоизмененные корни (с центральным проводящим пучком). Приэтом подавление экспрессии KNOX3 с помощью РНК-интерференции не влияло насам процесс закладки клубеньков, что может быть связано с участием ТФ KNOX3 вконтроле более поздних стадий развития клубеньков.
Такие данные на наш взглядсвидетельствуют о том, что стимуляция ТФ KNOX3 необходима для специализацииструктур клубенька. На основании экспериментов по подавлению исверхэкспрессии гена KNOX3 было установлено, что этот ТФ может стимулироватьбиосинтез цитокининов, влияя на гены, кодирующие ферменты IPT3 и LOG1,LOG2. Более того, активация KNOX3 может быть связана с развитиеминфекционного процесса, поскольку у мутантов с нарушением выхода бактерий изинфекционных нитей, увеличение экспрессии этого гена не наблюдается.Выполненные нами эксперименты показали, что ген WOX5 играет особуюроль на ранних этапах клубенькообразования, стимулируя пролиферацию клетокпри формировании примордиев.
На более позднем этапе развития клубенькапроисходит подавление экспрессии WOX5 за счет механизмов авторегуляции сучастием CLAVATA-подобной системы, функционирующей в побеге. ВыявленныеособенностирегуляцииэкспрессииWOX5приклубенькообразованииподтверждают существование общих механизмов контроля пролиферации идифференцировки клеток с участием генов WOX в апикальных меристемах и приразвитии специализированного органа – клубенька бобовых растений.
Экспрессиягена WOX5 при клубенькообразовании также регулируется CLAVATA-подобнойсистемой и CLE-пептидом, аналогично его гомологу – гену WUS, работающему впобеге. Однако особенность регуляции экспрессии гена WOX5 приклубенькообразовании заключается в том, что она осуществляется дистанционно сучастием CLE-пептидов.Обобщая данные по изучению влияния фитогормонов цитокининов иауксинов, а также ТФ KNOX3 и WOX5 на развитие клубеньков у гороха, можнопредставить следующую последовательность событий развития симбиоза. Приинокуляции в ответ на выделение ризобиями Nod-факторов у растений горохапроисходит первичная стимуляция продукции цитокининов в эпидермисе и корекорня.
Увеличение содержания цитокининов в коре корня приводит к релокализации белков PIN и локальному увеличению содержания ауксинов.Увеличение концентрации ауксинов стимулирует экспрессию гена WOX5, чтоможет приводить к инициации развития клубеньков. Вероятно, WOX5 играетособую роль на ранних этапах клубенькообразования, стимулируя пролиферациюклеток при формировании примордиев. В формирующихся клубеньках усиливаетсяэкспрессия гена, кодирующего ТФ KNOX3, который способен дополнительностимулировать биосинтез цитокининов с помощью IPT и LOG.
При этомувеличениеконцентрациицитокининовможетвлиятьнапроцессэндоредупликации и дифференцировки клубеньков и снижение уровня защитныхсистем растения, позволяющих развитие внутриклеточной инфекции. Наконец,закладка клубеньков способствует выработке регуляторного сигнала CLE-пептида,который поступает в побег, связывается там с системой рецепторов CLAVATA, чтоспособствует появлению сигнала, перемещающегося в корень и ингибирующегодальнейшую закладку клубеньков посредством подавления экспрессии WOX5.37ВЫВОДЫ1.
Узнавание Nod-факторов растениями гороха сопровождается независимойактивацией различных сигнальных путей, специфичными маркерами которыхявляются гены нодулинов PsEnod5 и PsEnod12a. Это свидетельствует о вовлечениив рецепцию этих молекул нескольких рецепторов, контролирующих разные этапыразвития симбиоза.2. Анализ связывающей способности рецептор-подобных киназ Sym10 и Sym37,наработанных в бактериях E. coli и листьях табака N. benthamiana, выявил низкуюаффинность к Nod-факторам, что предполагает наличие в рецепторных комплексахдополнительных белков с высокой аффинностью к Nod-факторам.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
