Автореферат (1144751), страница 4
Текст из файла (страница 4)
Анализ мутантных линий 885 (замена G332D332 в активационной петлекиназного домена) и 817 (замена Р146 S146 в LysM3-мотиве внеклеточного домена)показал, что в ответ на инокуляцию у них блокируется развитие симбиоза (Nodфенотип) (рисунок 4). При этом у мутанта 885 нарушение развития симбиозанаблюдалось на очень ранней стадии – до скручивания корневых волосков, чтосвидетельствует о необходимости LysM-РПК К1 для инициации симбиоза.Сходный фенотип был выявлен у мутанта гороха по гену sym10 (Madsen et al.,2003).
У линии 817, вероятно из-за более слабого влияния мутации, наблюдалинарушение развития инфекционных нитей и закладки примордиев клубеньков наранних стадиях, а также отсутствие выхода бактерий из инфекционных нитей.Таким образом, на основании анализа мутантов были получены доказательстватого, что К1 рецептор необходим для инициации развития симбиоза.Рисунок 4. Анализ мутантов гороха 885 (верхняя панель) и 817 (нижняяпанель) по гену k1. A – Nod- фенотип мутанта 885; Б, В – нарушение развитиясимбиоза на ранней стадии до скручивания корневых волосков; Г – мутант 817,нарушение роста и развития инфекционных нитей (IT), Д – остановка развитияпримордиев клубеньков, Е - абортирование IT, отсутствие выхода бактерий.
IT –инфекционная нить, NP – примордий клубенька. Для визуализации бактерий былиспользован штамм Rlv CIAM1026, содержащий плазмиду pJP2neo-gusA.Более того, схожее влияние мутации в гене sym10 и k1 (линия 885), а такжеданные об отсутствии функциональной активности киназного домена у Sym10позволяют нам предположить, что рецепторы Sym10/K1 могут формироватьгетеродимерный комплекс, который контролирует начальные этапы развитиясимбиоза у гороха. Таким образом, нами впервые была выявлена LysM-РПК угороха, которая необходима для инициации развития симбиоза, по-видимому, вкомплексе с рецептором Sym10.1.4. Анализ способности рецепторов гороха Sym10, К1 и Sym37 формироватьолигомерные комплексы.Для изучения взаимодействия рецепторов Sym10, Sym37 и К1, была проведена котрансформация листьев N. benthamiana одновременно двумя конструкциями длясинтеза этих белков. При трансформации листьев конструкциями для синтезакаждого белка отдельно (моно-трансформация), наблюдали эффективный синтезкак белка Sym10, так и белков Sym37 и К1 через 48 часов после трансформации13(рисунок 5).
О синтезе каждого отдельного белка при этом судили по появлениюфлюоресцентного свечения мембран клеток листьев в трансформированнойобласти. Однако совместный синтез двух белков Sym10 и К1, а также Sym10 иSym37 приводил к развитию реакции гиперчувствительности (эффекту гибеликлеток) через 48 часов (рисунок 5).Рисунок 5. Анализ развития реакции гиперчувствительности при совместномсинтезе LysM-РПК гороха Sym10, K1 и Sym37 в листьях N. benthamiana(Kirienko et al., 2016). Рецепторы Sym10-RFP, Sym37-YFP и K1-YFP были локализованыв плазматической мембране при моно-трансформации (левая панель). Развитие реакциигиперчувствительности наблюдали при совместном синтезе Sym10 + K1 и Sym10 + Sym37(правая панель, A – 2 дня после трансформации, B – 5 - 6 дней после трансформации).Реакция отсутствовала при синтезе Sym10 + Sym19 (контроль).Таким образом, на основании развития реакции гиперчувствительности прико-трансформации листьев N.
benthamiana конструкциями для синтеза белковрецепторов можно сделать вывод о том, что взаимодействие между Sym10 и К1, атакже Sym10 и Sym37 является специфичным и необходимым для передачи сигналав клетку. Это свидетельствует о возможности формирования двух рецепторныхкомплексов при узнавании Nod-факторов у гороха.Часть 2. Поиск рецепторов гороха, необходимых для узнаванияхитоолигосахаридов с разной степенью полимеризации.В настоящее время у бобовых растений не выявлено рецепторов, связывающиххитоолигосахариды (ХОС) с разной степенью полимеризации, поэтому большойинтерес представлял их поиск у гороха. Выполненные ранее исследования на рисе иарабидопсисе позволили выявить рецептор CERK1, который контролирует у этихрастений связывание ХОС (Shimizu et al. 2010; Liu et al., 2012).
При этом у рисарецептор CERK1 – бифункциональный, он контролирует связывание ХОС (n = 8),стимулирующих развитие защитных реакций, но кроме того в комплексе с другимко-рецептором участвует в узнавании и коротких ХОС (n = 4-5), необходимых дляразвития симбиоза с грибами арбускулярной микоризы (АМ). Мы предположили,что у гороха CERK1-подобный рецептор может осуществлять сходную функцию.2.1. Поиск и изучение генов – кандидатов на роль рецепторов кхитоолигосахаридам у гороха.Для поиска кандидатов на роль CERK1-подобного рецептора у гороха был проведенфилогенетический анализ с использованием кодирующих последовательностей 10Lyk генов M.
truncatula, 9 генов P. sativum, 8 L. japonicus и 5 A. thaliana. Анализпоказал наиболее близкое филогенетическое родство между AtCERK1 и PsLyk9.Кроме того, среди 5 Lyk генов Arabidopsis, самый высокий уровень сходства 63%был выявлен между AtCERK1 (At3g21630) и PsLyk9 на уровне кодирующихпоследовательностей.
На основании этого мы предположили, что ген PsLyk9 может14кодировать CERK1-подобный рецептор к ХОС.2.2. Анализ участия LysM-РПК Lyk9 в узнавании коротких олигомеров хитина(n = 4 -5), необходимых для развития симбиоза с грибами АМ.Мы предположили, что рецептор PsLyk9 может участвовать в контроле реакцийрастений на ХОС (n = 4 -5), которые необходимы для развития симбиоза с грибамиАМ. Для проверки данной гипотезы нами была проведена работа по поиску ианализу экспрессии генов-маркеров, которые активируются у растений в ответ намикоризацию.
Кроме того, нами была решена задача биосинтетического полученияолигомеров хитина со степенью полимеризации n = 5. Предложенный новый способполучения этих соединений был связан с конструированием штаммов E. coli –суперпродуцентов ХОС. Анализ литературных данных по изучениютранскриптомов микоризованных корней бобовых растений позволил выбратьнабор генов, экспрессия которых существенно возрастает при развитии AM.
Срединих уже известные маркеры развития микоризы у гороха – AM1, AM3, AM5, MAPK,PT4, TI и DRP (Roussel et al., 2001; Grunwald et al., 2004) и M. truncatula - GST,RAM1, RAM2, NSP1, NSP2, DWARF27, DELLA, TF (Wulf et al., 2003; Liu et al., 2011;Hogekamp et al., 2011; Ortu et al., 2012; Delaux et al., 2013). После выявлениягомологов всех 15 генов у гороха сорта Finale, нами был проведен анализ ихэкспрессии при микоризации корней гороха Rhizophagus irregularis на 7, 14 и 28сутки после заражения (рисунок 6).Рисунок 6. Анализ экспрессии генов-маркеров в корнях микоризованныхрастений Finale на 7, 14 (а) и 28 (б) сутки после заражения. Результатыпредставлены в виде отношения уровней экспрессии изучаемого гена в варианте сзаражением к контрольному без заражения. Myc 7,14, 28 dai после заражения грибами АМ.Полученные результаты показали, что экспрессия большинства маркеров начинаетувеличиваться на 7 день после заражения, а затем достигает максимума либо к 14,либо к 28 дню после заражения.
Увеличение уровня экспрессии в ответ намикоризацию было показано для всех 15 генов, что свидетельствовало о том, чтовыбранные гены могут являться маркерами развития микоризы у гороха. Кроме15того, в процессе микоризации увеличивалась и сама экспрессия гена PsLyk9(рисунок 6).При анализе микоризованных растений было оценено увеличение экспрессиигенов гороха в ответ на выделение двух типов сигналов – ХОС и Myc-факторов.Основное наше предположение было связано с тем, что Lyk9 контролируетреакцию растений на выделение ХОС. В связи с этим в дальнейших экспериментахбыли проанализированы уровни экспрессии генов-маркеров развития микоризногосимбиоза в трансгенных корнях гороха с подавлением экспрессии гена PsLyk9 вответ на обработку ХОС (n = 5). Нам удалось показать, что при подавленииэкспрессии гена PsLyk9-RNAi (в наших экспериментах на 80%) в ответ на обработкуХОС (n = 5) происходит достоверное снижение экспрессии 6 генов из 15 - DRP,RAM1, DELLA, DWARF27, NSP2 и PT4 (рисунок 7).Рисунок 7.
Анализ уровней экспрессии генов-маркеров развития микоризногосимбиоза в корнях трансгенных растений с подавленной экспрессией генаPsLyk9 в ответ на обработку ХОС (n = 5). Результаты представлены в видеотношения уровней экспрессии изучаемого гена у растений, трансформированныхконструкцией для РНК-интерференции (PsLyk9-RNAi) и для синтеза белка βглюкуронидазы (GUS-OE, контроль).Таким образом, рецептор Lyk9 контролирует процесс микоризации у гороха ипри этом вовлечен в ответ растений на обработку ХОС (n = 4 - 5), чтосвидетельствует в пользу предположения о том, что этот рецептор необходим дляузнавания ХОС с низкой степенью полимеризации.2.3.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
