Диссертация (1144279), страница 12
Текст из файла (страница 12)
Скоростные карты Картыпространственного распределения скорости клеток с магнитными микрокапсулами расчитывались на основе серий из 100 последовательных изображений.77КМОПкамератубуснаялинзасветофильтрдихроичноезеркалоколлиматорлазерный модульобъективстеклянныйкапиллярмагнитныйпинцетклеткимагнитныекапсулыфокальнаяплоскостьклеточнаяколонияконденсорбелыйсветодиодРисунок 4.1 — Экспериментальная установка для визуализации иуправляемого магнитного захвата суспензии клеток в стеклянном канале.4.34.3.1Результаты и обсуждениеИнтернализация магнитных микрокапсулСхема эксперимента по магнитному удержанию клеток показана нарисунке 4.1.
В данной работе использовался микроскоп, оснащенный электромагнитным пинцетом, описанный в главе 3 (см. рисунок 3.1,3.2). На рисунке 4.10 представлены СЭМ изображения данных магнитных флуоресцентных микрокапсул (PAH/PSS) и их конфокальные изображения.
Размермикрокапсул оценивался по СЭМ изображениям и составлял порядка 2-3мкм.78А10 мкмБ5 мкмВ10 мкмРисунок 4.2 — Изображения флуоресцентных микрокапсул, полученныепри помощи сканирующего электронного микроскопа (а, б) ифлуоресцентного конфокального микроскопа (в)Выбор подобных микрокапсул для магнитного захвата клеток МА-104обуславливается следующими факторами: 1) не биоразлогаемые полимерыPAH/PSS имеют низкую цитотоксичность, что позволяет интернализироватьносители на их основе в живые системы и отслеживать их биораспределенеи с течением продолжительного временного интервала; 2) функционализация PAH/PSS микрокапсул флуоресцентной меткой (TRIC) позволяетвизуализировать микрокапсулы в живых клеточных носителях; 3) функционализация PAH/PSS микрокапсул магнитными наночастицами позволяетуправлять движением данных микрокапсул при помощи внешнего градиентного магнитного поля.Рисунок 4.3 — Конфокальная 3D реконструкция изображений клетокМА-104 с интернализованными микрокапсулами.
Клетки меченыекальцеином (а); TRITC флуоресценция микрокапсул (б); Положение капсулв живое клетке (в).Для визуализации микрокапсул в поглотивших их клетках, данныеклетки окрашивались кальцеином в соответствии с протоколом производи-79теля. Далее микрокапсулы в клетке визуализировались при помощи методатрёхмерной реконструкции по серии конфокальных флуоресцентных изображений (рисунок 4.3).Рисунок 4.4 — Интернализация капсул, меченых TRITC (красный), вклеткки МА-104, окрашеные кальцеином (зелёный). Время указано вминутах, с момента добавления суспензии микрокапсул.На рисунке 4.4 зарегистрирован процесс поглощения микрокапсулклетками МА-104. Поглощение микрокапсул длится порядка часа, но первые капсулы попадают в клетки уже через 30 минут.
После этого в экспериментах с клеточной линией MA-104 была проведена оценка цитотоксичности данных микрокапсул, используя качественные (пролиферация, адгезия иморфология клеточной линии) и количественные (анализ Аламара) методыанализа (рисунке 4.5). Клетки MA-104 имеют эпителиальную морфологию(они создаются из эмбриональной почки африканской зеленой обезьяны).В нашей работе мы использовали данные клетки, потому что они обладают хорошей адгезией и высокой пролиферацией, а также способны быстроформировать жизнеспособный клеточный колонии в виде монослоя.80MA-104viability, %Выживаемость клеток, %10590756045301505102550100controlКоличество капсулна одну клетку, шт.caps/cellРисунок 4.5 — Тест цитотоксичности микрокапсул PAH/PSS для клеточнойлинии МА-104.Зависимость выживаемости клеток от количества добавленных к ниммикрокапсул представлена на рисунке 4.4,4.5.
В клеточный планшет добавлялась суспензия микрокапсул в концентрации от 5 до 100 микрокапсул наклетку. Контрольная группа клеток МА-104 культивировалась без добавления микрокапсул. Концентрация от 5 до 10 капсул на клетку не являетсястатистически отличимой от контрольной группы. Концентрация 25 и 100капсул на клетку оказывает малое влияние на её жизнеспособность. Клеткипоглотившие микрокапсулы (добавление 10 микрокапсул на клетку) демонстрируют достаточную клеточную адгезию, демонстрируют типичную морфологию (для линии МА-104) прикреплённых клеток к клеточной подложкеи однородность распределения клеточной колонии (наблюдали 24, 48 и 72часа).814.3.2 In vitro магнитная адресация клеток в стеклянном каналеВ данном разделе исследовалась проблема формирования жизнеспособной клеточной колонии (МА-104) в стеклянном канале.
Смесь живыхклеток MA-104 в специальном клеточном питательном растворе прокачивалась через стеклянный канал с помощью шприцевой помпы (однонаправленные инфузионные насосы Cole-Parmer, Англия) с параметрами объемного расхода 200 мкл/с. Подобный объёмный расход крови соответствуетфизиологическим скоростям малых венул и артериол.Рисунок 4.6 — Схема эксперимента магнитного захвата клеток встеклянном капилляре, при помощи магнитного пинцета.Капилляр был помещен в зазор между электромагнитными наконечниками таким образом, чтобы нижний наконечник не затенял поле зрениямикроскопа, при наблюдении в проходящем свете.
После заполнения капилляра с помощью клеточной суспензии, электромагнит включался, в результате чего, в зоне наибольшего напряжения магнитного поля захватывалсямассив клеток. На рисунке 4.8а представлена колония клеток, образованнаяградиентным магнитным полем. Время магнитного воздействия составляло 5 секунд. На рисунке 4.8б представлена карта магнитой индукции магнитного пинцета относительно захваченной колонии клеток. Показано, чтоклеточная колония сформирована в зоне с магнитным полем порядка 0,5Т.
Для этой зоны градиент магнитного поля G составляет 180 Тл/м, что82соответствует значениям градиента магнитного поля используемого в МРТсистемах. Градиент магнитного поля G определяется следующим образом:Δ,(4.1)Δгде G - градиент магнитного поля, Δ B - изменение магнитной индукции, делённое на изменение в расстоянии Δ S .=Рисунок 4.7 — Карта распределения градиента магнитной индукцииотносительно поля зрения микроскопа и стеклянного каналаКарта скоростей потока суспензии клеток в стеклянном канале до ипосле магнитного воздействия представлена на рисунке 4.9а,б.
Измереннаялокальная скорость потока клеток представлена в виде цветового градиента,где минимальное значение локальной скорости потока клеток 0,5 мм/с кодируется синим цветом, а максимальная скорость 4 мм/с кодируется краснымцветом. Положение магнитных концентраторов, относительно стеклянногоканала, выделена фиолетовым контуром в верхней части рисунка 4.9б. Границы стенки стеклянного канала указаны белой пунктирной линией.
Клеткистремятся сместиться к оси потока суспензии клеток, так как в этой области градиент значений скорости минимален [133]. Поэтому скорость клетокв центре канала выше, чем в зоне формирования клеточной колонии. По-83а)б)Рисунок 4.8 — Клеточная колония, сформированная градиентныммагнитным полем (а). Распределение магнитной индукции в поле зрениямикроскопа (б)а)б)Рисунок 4.9 — Поля скоростей магнитных клеток до и после магнитноговоздействия.сле активации магнитного поля клетки начинают агломерироваться междусобой. В результате образуются зоны без частиц-трассеров и как следствиепустоты в картах полей скоростей. По той же причине колония формируется не из одиночных захваченных клеток, а из их агломератов, что приводитк несимметричному контуру колонии.После формирования клеточной колонии (MA-104) стеклянный каналотсоединялся от проточной системы и помещался в чашку Петри с клеточным питательным раствором.
В течение пяти дней, рост клеток контролировался с использованием кальцеинового красителя и флуоресцентной ви-84Рисунок 4.10 — Флуоресцентные изображения клеточная колония, послемагнитного захвата в стеклянном капилляре, спустя 24 ч(а) и 96 ч(в)соответственно. Клетки прокрашивались кальцеином.зуализации. За данный период колония увеличивается с десятков до сотенклеток. На рисунке 4.10 показаны захваченные клетки в стеклянном каналечерез 24 и 96 часов, соответственно, после эксперимента. Основываясь нафлуоресценции клеток, покрашенных кальцеином, мы можем заключить,что клетки живы; они обладают хорошей адгезией к стенке стеклянногососуда, нормальной пролиферирующей активностью и способностью образовывать клеточный монослой.МА-10480viability,%Выживаемость, %1006040200ЧашкаСтеклянныйcapillaryPetridishПетриканалРисунок 4.11 — Выживаемость клеток с магнитными капсулами послемагнитного воздействия в стеклянном канале и в чашке Петри.85Морфология клеток также характерна для клеточной линии MA-104.На пятый день после эксперимента клетки трипсинизировались.
На рисунке4.11 показаны результаты анализа клеточной выживаемости (Alamar Blue).Клеточная линия MA-104 высевалась в чашку Петри и культивироваласьв DMEM в течение пяти дней, после трипсинизации и использовалась вкачестве контроля. Из диаграммы видно, что активность пролиферацииклеток на капиллярной стенке и в чашке Петри имеет схожий уровеньжизнеспособности.4.3.3Выводы к главеВ данной главе диссертационной работе была впервые продемонстрирована возможность захвата клеток МА-104, поглотившие магнитные флуоресцентные микрокапсулы, in vitro в стеклянном канале, при помощи электромагнитного пинцета, для формирования жизнеспособной клеточной колонии. Полученные данные показали, что добавление суспензии полимерных микрокапсул к суспензии клеток в концентрации до 10 капсул на единичную клетку, не оказывает значимого влияния на выживаемость клеточной линии МА-104.
При этом клетки поглощают полимерные микрокапсулы, изолируя инкапсулированные агенты от действия окружающей среды. За счёт наличия наночастиц магнетита в оболочке поглощённых микрокапсул, перемещениями клеток возможно управлять при помощи внешнего градиентного магнитного поля. Захваченные магнитным полем клеткилинии МА-104 сформировали жизнеспособную клеточную колонию в стеклянном канале прямоугольного сечени. Данная технология клеточного переноса имеет перспективы в области клеточной трансплантологии, регенеративной медицины и адресной доставки лекарственных средств к целевымучасткам биологической ткани.86Глава 5. Оптоптоволоконная активация полимерной трёхмерноймикроструктурированной плёнки5.1ВведениеПолимерные трёхмерные микроструктурированные плёнки (ПТМП)являются новым типом микроносителей, который представляет собой полимерную нанопленку, периодически усеянную массивом полых трёхмерных микроконтейнеров.
ПТМП плёнки позволяют равномерно распределлить биологически активные вещества по протяжённой поверхности.ПТМП могут быть получены либо посредством трёхмерной литографии, либо посредствам методов ПА сборки. Метод осаждения ПА основан на поглощении альтернативных заряженных полиэлектролитов, которые приводят к самосборке поликатион-полианионных электростатическисшитых пленок. Этот метод позволяет включать заряженные плазмонныенаночастицы, такие как наночастицы золота (AuNP), в стенки ПТМП илипокрывать наночастицами золота внешнюю поверхностью ПТМП. Наночастицы золота способны эффективно абсорбировать световую энергию ипреобразоваывать её в тепло, что приводит к локальному повышению температуру вокруг данных наночастиц и обеспечивает вскрытие герметичныхмикроконтейнеров ПТМП, путем плавления полимерной оболочки вблизинаночастиц золота.В этой работе мы демонстрируем возможность лазерной ИК активации фоточувствительных ПТМП в толще фантома мягких тканей на основе1% агарозного геля, при подводе излучения через многомодовое волокно.Фантомы биологических тканей на основе агарозного геля способны демонстрировать, диссипацию тепловой энергии, рассеяние и поглощение света,аналогичные мягким тканям.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
