Диссертация (1144279), страница 16
Текст из файла (страница 16)
Флуоресценция ЗФБ регистрировалась при помощи того же объектива FUC LUNPlan FLX 60х/0,7 Ph2 и затем изображалась тубусной линзой (f=180 мм)на монохромный датчик КМОП камеры (DCC3260M, Thorlabs inc., США).Перед КПОМ датчиком изображений помещался ИК фильтр. Оптическая111мощность лазерного пучка составляла 12,5 мВт. Размер пятна фокусировки лазерного пучка составлял порядка 1 мкм. Время воздействия лазерногоИК пучка на единичный микроконтейнер ПТМП, контролировалось механическим оптическим затвором и составляла порядка 0,5 с.
В течение всегоэксперимента чашка петри с клетками С2С12 находилась в термостатическом инкубаторе, закреплённом на предметном столике инвертированногомикроскопа, при температуре 37 0 С и 5% CO2 .6.36.3.1Результаты и обсуждениеФототермическая активацияПосле синтеза ПТМП, проверялась возможность фототермической активации микроконтейнеров ПТМП посредствам сфокусированного ИК лазерного пучка (830 нм). Обычно полислойные полиэлектролитные системы функционализируются ЗНЧ при помощи полиионной сакмосборки, однако биополимер PLA заряжен нейтрально.
Поэтому ЗНЧ напылялись наповерхность PLA ПТМП в вакууме. Времени напыления ЗНЧ ниже 30 с,приводит к образованию слоя изолированных наночастиц (режим одиночной наночастицы). Увеличении времени напыления ЗНЧ до 45-60 секунд,формирует плёнку ЗНЧ, с размерами наночастиц 3-25 нм. Кумулятивныесвойства ЗНЧ плёнки значительно выше, так как если расстояние междунаночастицами меньше чем их диаметры, то фототермический нагрев усиливается [142; 148].Для экспериментов по высвобождению инкапсулированного веществаиз ячеек ПТМП 6.3, механический лазерный затвор открывался вручную,от одной до нескольких секунд, в зависимость от используемой мощностиИК лазера. Микроконтейнеры ПТМП, изготовленные при помощи 1% PLA,легко открывались с использованием TEM00 лазера 830 нм, 55 мВт привремени воздействия порядка 1 секунды. Для ПТМП микроконтейнеров на112основе 2-3% PLA, выходная мощность лазерного пучка увеличивалась до99 мВт.
Вплоть до вскрытия биополимерной ячейки, преципитат остаётся вмикроконтейнере, окружённый пузырьком воздуха, что является дополнительным гидрофобным слоем, препятствующий растворению преципитата.После активации микроконтейнера, преципитат растворяется в течении 1517 секунд в воде и распространяется в окружающей среде, как показанона рисунке 6.3. Угасание флуоресценции RhB в зоне воздействия 6.3д обуславливается растворением RhB, так как на данной длине волны лазерногомодуля (830 нм), RhB краситель не поглощает [152].
При лазерном воздействии на ПТМП с RhB без ЗНЧ, тушения флуоресценции RhB не обнаружилось. RhB является термостабильным красителем, который не теряет своихфлуоресцентных свойств при 20 часовом автоклавировании при темпиратуре 150-1800 , поэтому термическое повреждение флуоресцентного карго,вблизи температуры стеклования или температуры плавления полимера, неожидается [153].6.3.2Лазерная адресацияPLA может быть использован в качестве клеточного субстрата клетокC2C12 на своей поверхности, что коррелирует с более ранними исследованиями о развитии хондроцитов на PLA системы и его использованиемв качестве имплантационного материала (рисунок 6.1г,д) [154]. Было обнаружено, что клетки распространяются так же, как и на стандартных клеточных ]подложках, и предпочтительно располагаются в областях междумикроконтейнерами ПТМП, на плоской поверхности ПТМП (рисунок 6.1).Было обнаружено, что некоторые клетки растягиваются через микроконтейнеры ПТМП МС без существенной деформации, из-за того, что клеткизначительно больше ПТМП микроконтейнеров и пространства между ними, соответственно.
Данные наблюдения согласуются работами по анализуповедения клетки на подложке [155]. Важно отметить, что случайная миграция клеток C2C12 на ПТМП за 24 часа достигала 15 мкм. Эта скорость113Рисунок 6.3 — Фототермическая активация 2% PLA микроконтейнераПТМП, посредствам сфокусированного лазерного ИК пучка.Светлопольное изображение ПТМП, до лазерного воздействия (а),Светлопольное изображение ПТМП, после 0,35 с лазерного воздействия(б), Светлопольное изображение ПТМП, после 1,35 с лазерноговоздействия (в), Флуоресцентное (RhB) изображение ПТМП, до лазерноговоздействия (г), Флуоресцентное изображение ПТМП, после лазерноговоздействия (д), СЭМ изображение единичного микроконтейнера ПТМП,после лазерного воздействия (е).движения достаточно мала, что позволяет напрямую соотносить положениеклетки с ЗФБ и положение активированного ПТМП микроконтейнера.
Каки RhB, DOX может был преципитирован в микроконтейнеры ПТМП и вдальнейшем был использован в качестве модели биологически активноговещества.114Рисунок 6.4 — Дизайн эксперимента по фототермической активацииэкспрессии ЗФБ единичных генетически модифицированных клеток наПТМП клеточном субстрате (а), 10х светлопольное изображение ПТМП склеточной колонией, до лазерного воздействия (б), зона лазерноговоздействия на единичный микроконтейнер ПТМП возле С2С12 клетки, дофототермической активации (в), зона лазерного воздействия на единичныймикроконтейнер ПТМП возле С2С12 клетки, после фототермическойактивации (г), конфокальные флуоресцентные изображения прокрашеныхядер и цитоскелета клеточной колонии в зоне фототермической активациимикроконтейнера ПТМП (д), конфокальные флуоресцентные изображенияЗФБ клеточной колонии в зоне фототермической активациимикроконтейнера ПТМП (е), наложение флуоресцентных каналов (ж)При активации ПТМП микроконтейнера DOX воздействует натетрациклин-зависимые рецепторы генетически модифицированных клетокC2C12, запуская ЗФБ экспрессию.
Подобные клетки обладают высокой чувствительностью к DOX [151]. Подобная восприимчивость делает эти клет-115ки надёжным инструментом оценки количество высвобожденных веществ иэффективности направленного воздействия биологически активных компонентов ПТМП. Известно, что подобная система контроля экспрессии геновчувствительна менее чем к 10 пг/мл DOX [151].
Таким образом высвобождение порядка 10 пг DOX из единичного микроконтейнера ПТМП являетсядостаточным для экспрессии ЗФБ единичных клеток (рисунок 6.4 и рисунок 6.5). Клетки, демонстрирующие экспрессию ЗФБ вблизи (расстояниедлины клетки) активированного микроконтейнера ПТМП, считаются «положительными», клетки без ЗФБ (на том же расстоянии от МК) считались«отрицательными». Клетки, экспрессирующие ЗФБ, в отдалении от активированных МК, сфитались «ложноположительными» (рисунок 6.5). Из-завысокой чувствительности клеток к DOX, внашем эксперименте не наблюдалось «отрицательных» клеток.
22% клеток были идентифицированы как«ложноположительные», которые, возможно, были привнесены на ПТМПдочерними клетками, содержащими ЗФБ, в их цитоплазме после деления.Клеточный отклик на DOX и, следовательно, разница между ложноположительными и положительными клетками значительна (t-тест p <0,05).
Крутойградиент концентрации DOX, который убывает согласно формуле 6.1, отвечает за высокую чувствительность клеток к DOX.=0,0,53(6.1)где - локальная концентрация, 0 - концентрация источника в МК, а - расстояние от МК. В пределах одного клеточного диаметра (от 10 до 30мкм в зависимости от диаметра ячейки) концентрация уменьшается в пределах от 2 до 10 относительных единиц. Была проведена оценена ЗФБ флуоресценции клеток ЗФБ на различных концентрации DOX (рисунок 6.5е),а также была проведена оценка относительно ожидаемого высвобождаемого объёма DOX из ПТМП микроконтейнера.
Определенная минимальнаяконцентрация DOX для экспрессии ЗФБ соответствует литературе [16; 151],в которой была определена концентрация DOX для максимального ответа ЗФБ, после чего жизнеспособность клеток и, следовательно, экспрессияЗФБ и плотность клеток уменьшались. Было отмечено, что активация МК116между двумя клетками способен стимулировать экспрессию гена в обеихклетках.Установлено, что единичный ПТМП микроконтейнер способен экспрессировать ЗФБ по меньшей мере в одной клетке. Чтобы избежать высвобождения избыточного количества доксициклина, следует избегать активации нескольких бизлежащих микроконтейнеров и сохранять минимальное расстояние по меньшей мере двух МК друг от друга.
В экспериментахактивации нескольких соседних МК ПТМП приводило к экспрессии ЗФБв нескольких не целевых клетках, в поле зрения микроскопа. Этот эффектобъясняется тем, что из нескольких МК высвобождается значительное количество DOX. Другие расхождения между позицией флюоресцентных клетоки открытым МК объясняются миграцией клеток, которая может составлятьдо 15 мкм. Поэтому для определения концентрации экспозиции биологически активного вещества важно учитывать начальную позицию клетки, а нееё текущее положение на клеточной подложке.117Рисунок 6.5 — Подковообразная область свечения ЗФБ клеток созданнаяпосредствам локальной активации серии микроконтейнеров ПТМП.Красными стрелками обозначены вскрытые микроконтейнеры лазернымвоздействием (а), Белыми стрелками указаны клетки, возле активированнымикроконтейнеров, которые начали экспрессировать ЗФБ (б), наложениеканалов флуоресценции ЗФБ и канала визуализации клеток С2С12 (в),процентное соотношение клеток, возле вскрытых микроконтейнеровПТМП, которые запустили экспрессию ЗФБ (г), численная модельраспределения относительной концентрации высвобожденногодоксициклина из единичного микроконтейнера ПТМП, диаметром 5 мкм(д), зависимость интенсивности свечения клеток (ЗФБ экспрессия) отколичества DOX в мгл/мл.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
