Диссертация (1144279), страница 11
Текст из файла (страница 11)
Для задач противораковой терапии, частично или полная блокировкасвязанных с опухолью процессов неоваскуляризации посредствам микрокапсул, захваченными магнитным полем, может оказывать дополнительноетерапевтическое воздействие [125]. Суммируя описанные выше экспериментальные данные, мы продемонстрировали, что предложенная концепциядля магнитно-вспомогательной доставки инъецированных микрокапсул может быть эффективно использована для локализации капсул в целевой области биоткани. Хотя доставка капсул и самого электромагнитного пинцетак глубоко залегающим тканям без хирургического вмешательства являетсяне решаемой задачей, на сегодняшний день существуют исследования invitro и in vivo по локализации магнитных носителей градиетными электромагнитными катушками МРТ систем [33; 126]. Подобные системы способны создавать достаточно мощный градиент магнитного поля на достаточнобольшой глубине биоткани, чтобы перемещаться по магнитные носители впечени кролика.713.7Анализ динамики кровотока до и после введения микрокапсулметодами PIVПрименения полимерных систем доставки лекарственных средств, через системный кровоток сопряжено с рисками образования тромбов.Рисунок 3.12 — Карта распределения скоростей крови сети сосудовбрыжейки крысы до (а,в) и после (б,г) введения многослойных магнитныммикрокапсул в системный кровоток, с последующим магнитным захватоммикрокапсул, посредствам магнитного пинцета.72В данной работе использовались многослойные полимерные микрокапсулы PAH/PSS, размерами 3-5 микрометров, что соотносится с размерами эритроцитов человека.
Оболочка полимерных микрокапсул как правилонамного жёстче оболочки эритроцита, что не позволяет микрокапсуле скручиваться, подобно эритроциту, при прохождении мельчайших капилляров.Для визуализации динамики кровотока до и после введения и магнитногозахвата полимерных микрокапсул, использовался метод маскирования сосудистых ветвлений методами пространственной локальной фильтрации яркостных изображений сосудистых сетей с последующим расчётам полейскоростей крови методами адаптивного PIV анализа (рисунок 3.12).Маскирование сосудистых сетей производилось методом локальногопорогового преобразования Ниблэка по серии из 50 изображений, при скорости серийной записи движении крови 187 кадров в секунду.
Далее расчётные зоны размером 50х50 мкм распологались равномерно вдоль маскисети сосудов с шагом в 5 мкм. Карты скоростей крови расчитывались посерии из 100 кадров.На рисунке 3.12а,б представлены векторные поля скоростей крови артериального участка кровотока брыжейки мыши до и после ведения многослойных магнитным микрокапсул в артерию брыжейки, выше по течению, споследующим магнитным захватом микрокапсул, посредствам магнитногопинцета. Наглядно показано, что после введения микрокапсул в системныйкровоток, не произошло значительных изменений кровоснабжения, в зонемагнитного воздействия.
Произошло переключение некоторых мелких капилляров, брыжейки вблизи зоны воздействия, однако крупные питающиемагистрали продолжили функционировать.3.8ВыводыБыла разработана методика визуализации флуоресцентных микрокапсул in vivo в потоке крови и меих адресацию магнитным. Эксперименты invitro на стеклянной трубке демонстрируют возможность захвата капсул в73кровотоке локально приложенным неоднородным постоянным магнитнымполем. Удаление магнитного поля приводит к отсоединению большинствамикрокапсул от стеклянных стенок капилляра.
Эксперименты in vivo, проведенные на брыжеечных сосудах белых крыс, показывают, что капсулы могут быть успешно захвачены магнитным полем в сложных бифуркационныхучастках кровеносного русла. Капсулы остаются на изгибе сосуда после выключения магнитного поля. Гистологический анализ показывает, что капсулы проникают в мелкие брыжеечные сосуды, а крупные вены остаются разблокированными для кровотока. Хотя капсулы могут образовывать большиеагрегаты, кровоток остается неповрежденным, что подтверждается результатами наблюдений in vivo в реальном масштабе времени.
Гистологическиесрезы показали, что под действием магнитного поля микрокапсулы могутпроникать через эндотелий в стенки сосуда в течение эксперимента (3040 минут). Представленные экспериментальные данные демонстрируют потенциал многофункциональных капсул как дистанционно контролируемыхсистем доставки в биологических системах (например, различные виды рака кишечника). Было обнаружено, что внешнее магнитное поле удерживаеткапсулы в кровотоке в зонах изгибов и ветвлений васкулатурной сети.
Показано, что в зоне магнитного воздействия кровоток не блокируется послевведения и магнитного захвата многослойных микрокапсул.74Глава 4. Формирование клеточной колонии в потоке жидкости поддействие внешнего магнитного поля4.1ВведениеВ последние годы были предприняты значительные усилия для разработки методов адресной доставки умных клеточных носителей к целевым тканям, в рамках задач регенеративной и восстановительной медицины. Успех клеточной терапии во многом зависит от таких факторов, как:способности клетки к интернализации (фагоцитоз) биологически активныхвеществ, способность клеточного носителя удерживать карго и от возможности эффективной адресации инъецированной клетки в ее целевое местоположение [127–129]. В настоящее время нет оптимального способа гарантировать успешную доставку инъецированной клетки в ее целевое местоположение без таргетирующего агента [118; 130], так как клетки, вводимыев кровоток системно, будут циркулировать по всему организму, накапливаясь преимущественно в лёгких, почках и печени [131].
Одним из основныхспособом контроля перемещения клеточных носителей является применение магнитных внешних градиентных полей. Однако введение наночастицмагнетита непосредственно в живые клетки зачастую неэффективно, так какцитотоксичные наночастицы в таком случае будут негативно воздействоватьна жизнеспособность клетки и быстро покидать её пределы в силу своихмалых размеров [132]. Для решения этой задачи применялся метод функцианолизации полимерных микрокапсул (3-5 мкм), которые в свою очередьинтернализировались в живые клетки.
В отличии от наночастиц магнетита,полимерные магнитные микрокапсулы обладают контролируемой биоразлогаемостью, неиммуногенны и не обладают цитотоксическими эффектами.Целью данной работы являлось изучение возможности магнитного нацеливания изолированных клеток, включая их магнитный перенос, адгезиюи пролиферацию после магнитного перемещения. В качестве целевой системы доставки были использованы полимерные магнитные микрокапсу-75лы, которые были поглощены (фагоцитоз) модельными клетками МА-104.В перспективе данная методика позволит сосредоточить терапевтическийэффект в локализованной области в тканях пациента, что уменьшит потенциальные отрицательные эффекты клеточной терапии.4.2Материалы и методы4.2.1Клеточная линияВ рамках данной работы, использовалась клеточная линия MA-104(эмбриональная почка, макака резус).
Все клетки высевались отдельно вколбах для тканевых культур и культивировались в модифицированной среде Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM, SigmaAldrich) дополненной1% противогрибковым коктейлем из пенициллина-стрептомицина с антимикробным препаратом 2 мМ L-глутамина и 10% фетальной бычьей сывороткой. В клеточной инкубаторе потдерживалась темпиратура 37 и 5%концентрация 2 . Клеточная среда заменялась каждые 3 дня. Культурыклеток с 75-85% слиянием собирались с использованием 0,25% трипсина иподсчитывались с помощью гемоцитометра.4.2.2Колориметрическая оценка метаболической активности клетокКлетки помещались в 24 или 96-луночные планшеты.
На следующий день заменялась клеточная среда и добавлялась суспензия микрокапсул при соотношениях 5 и 100 капсул на единичную клетку. Клетки инкубировались (Innova CO-170, New Brunswick Scientific) в течение 4 часовпри темпиратуре 370 вместе с добавленными капсулами. Далее в каждуюлунку клеточного планшета добавляли 10 мкл флуоресцентного красителя76(AlamarBlue, Sigma-Aldrich) и затем измеряли спектрофотометром (GeminiXPS Microplate Reader, Molecular Devices) интенсивность свечения клеток.Эксперимент показывает способность метаболически активных клеток превращать реагент AlamarBlue в флуоресцентный колориметрический индикатор.4.2.3Визуализация динамики микропотоков клеточной суспензииВизуализация потока суспензии клеток методом светлого поля в стеклянном сосуде производилась при помощи цифровой системы визуализации(рисунок 4.1), состоящей из 10х/0,27 объектива длинным рабочим отрезком(WD = 34 мм, Nanjing KOZO CO., Китай), тубусной линзы f = 200 мми CMOS-камера (acA2040-180km, Basler Inc.).
Серия монохромных (8 бит)изображений движения клеток регистрировалась с частотой записи 187 кадров в секунду, при времени экспозиции 5 мс. Разрешение датчика изображения микроскопа составляло 2040х2048 пикселей, а поле зрения микроскопасоставляло 1275х1280 мкм в пространстве предметов.Скорость потока клеточных носителей с поглощёнными магнитнымифлуоресцентными капсулами, в стеклянном канале прямоугольного сечения2680х200 мкм, анализировалась PIV методом, до и после магнитного захвата клеток. Размер расчётных зон PIV метода составлял 200х30 пикселейили около 145x22 мкм в пространстве предметов.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
